生化工程第二 .ppt
生化工程学的起点生化工程学的起点l l1.1.1.1.抗杂菌污染的抗杂菌污染的抗杂菌污染的抗杂菌污染的纯种培养技术纯种培养技术纯种培养技术纯种培养技术(pure culture)(pure culture)(pure culture)(pure culture)：无菌空气、培养基灭菌无菌空气、培养基灭菌无菌空气、培养基灭菌无菌空气、培养基灭菌(sterilization)(sterilization)(sterilization)(sterilization)、无污染、无污染、无污染、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。l l2.2.2.2.通气搅拌通气搅拌通气搅拌通气搅拌解决了解决了解决了解决了液体深层培养液体深层培养液体深层培养液体深层培养时的供氧问题。时的供氧问题。时的供氧问题。时的供氧问题。建立关键技术建立关键技术建立关键技术建立关键技术：奠定生化工程学科基础。奠定生化工程学科基础。奠定生化工程学科基础。奠定生化工程学科基础。生物反应过程示意图目的：发酵过程要求纯培养 灭菌(sterilization):(sterilization):培养基(medium)空气 发酵罐及管道 消毒(disinfection)(disinfection)生产环境灭菌与消毒的区别？第一节 概述一一 灭菌方法灭菌方法二 培养基及设备的灭菌（进罐后或进罐前灭菌）1.分批灭菌 (batch sterilization)batch sterilization)实罐灭菌(实 消)：利用热空气或高压蒸汽 对培养基与发酵罐同时 灭菌。分批灭菌方法分批灭菌方法:预热加热冷却预热加热冷却分批灭菌的特点：分批灭菌的特点：分批灭菌的特点：分批灭菌的特点：适用于：适用于：培养基易发泡或黏度大培养基易发泡或黏度大优点优点：操作简便，无需连消的设备，并减少了杂菌污染的机会操作简便，无需连消的设备，并减少了杂菌污染的机会缺点缺点：升温降温时间长，设备利用率低升温降温时间长，设备利用率低2 2连续灭菌连续灭菌(continuous sterilization)continuous sterilization)(连消连消)：培养基通过连续灭菌装置，快速连续加热培养基通过连续灭菌装置，快速连续加热灭菌，后进入灭菌的空罐。培养基时间与温度的变化关系灭菌，后进入灭菌的空罐。培养基时间与温度的变化关系连续培养下时间与温度的变化关系连续培养下时间与温度的变化关系连续灭菌装置：1).连消塔保温罐连续灭菌 2).板式热交换器连续灭菌 3).蒸汽喷射连续灭菌 连消塔保温罐连续灭菌连消塔保温罐连续灭菌板式热交换器连续灭菌适用于各类饮料及工业液体加热、杀菌、冷却、蒸发、适用于各类饮料及工业液体加热、杀菌、冷却、蒸发、冷凝和热回收等多种工艺过程冷凝和热回收等多种工艺过程蒸汽喷射连续灭菌分批灭菌与连续灭菌的特点3.3.空罐灭菌：空罐体灭菌空罐灭菌：空罐体灭菌 罐压：罐压：1.51.52.0102.0105 5PaPa；罐温：罐温：125125130130，时间：时间：30304545minmin4.4.发酵附属设备及管道灭菌：发酵附属设备及管道灭菌：管道：罐压管道：罐压3.5103.5105 5PaPa；时间：时间：1 11.51.5h h 补料罐：糖水罐罐压补料罐：糖水罐罐压1.5101.5105 5PaPa；时间：时间：3030minmin 消泡剂罐罐压：消泡剂罐罐压：1.51.51.8101.8105 5PaPa；时间：时间：6060minmin 空气过滤器：罐压空气过滤器：罐压3.5103.5105 5PaPa；蒸汽从上至下通入蒸汽从上至下通入 第二节 加热灭菌的原理l l培养基灭菌要求：达到需要的无菌程度；有效成分受热破坏程度尽可能低。l l灭菌工作关键：控制加热温度（T）和受热时间(t)一、加热灭菌原理1 1、微生物的热阻：、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力称为热阻。微生物对热的抵抗力称为热阻。（1 1）微生物对热的抵抗能力）微生物对热的抵抗能力 l l 营养细胞：在营养细胞：在6060加热加热10 10 min min 全部死亡；全部死亡；l l 细菌芽孢：能耐较高的温度，在细菌芽孢：能耐较高的温度，在100100需几分钟需几分钟 或几小时。或几小时。l l 嗜热菌的芽孢：嗜热菌的芽孢：120120，39 39 min min 或更长时间或更长时间.（2 2）致死温度：）致死温度：杀死微生物的极限温度。杀死微生物的极限温度。（3 3）致死时间：）致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需在致死温度下，杀死全部微生物所需 要的时间。要的时间。2、微生物的热死规律-对数残留定律 热死亡动力学热死亡动力学(一级反应动力学一级反应动力学)规律：规律：菌的死亡速率dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比。即：dN/dt KN (1)dN/dtdN/dt：死亡速率，菌体瞬时变化率。死亡速率，菌体瞬时变化率。N N：残存活菌数，个残存活菌数，个 t t：灭菌时间（灭菌时间（minmin），），K K：比死亡速率常数或反应速率常数比死亡速率常数或反应速率常数minmin1 1 将(1)式移项积分：ln(Ns/N0)=Kt (2)可变形为：lnNs=Kt+lnN0 或 Ns=N0eKt 或 t=1/K*ln(N0/Ns)N N0 0：原有活菌数（原有活菌数（t=0,t=0,污染度）污染度）个 N Ns s：经经t t时间后残存活菌数（灭菌度，时间后残存活菌数（灭菌度，N Ns s10103 3）二 K比死亡速率常数（反应速率常数）1K大小反映微生物受热死亡的难易程度。与微生物的种类及加热温度有关；l l相同温度下，k值愈小，加热时间长，则此微生物愈耐热。即：t=1/K*ln(N0/Ns)同一种微生物在不同灭菌温度下，灭菌温度 愈低，k值愈 ；温度愈高，k值愈 。t=1/K*ln(N0/Ns)t=1/K*ln(N0/Ns)K是温度T的函数，故T对K的影响是热灭菌设计的核心问题之一。2温度T对K的影响l l T与K的关系关系，可用Arrhenius方程表示：K=AeE/RT K K：比死亡速率常数，也称反应速率常数（比死亡速率常数，也称反应速率常数（minmin1 1，s s1 1 ）A A：阿氏常数阿氏常数(min(min1 1 ，s s1 1 ）E E：活化能（活化能（J/molJ/mol）化学反应中，反应物分子到达活化分子化学反应中，反应物分子到达活化分子所需的最小能量。活化能的大小与反应速率相关，活化所需的最小能量。活化能的大小与反应速率相关，活化 能越低，反应速率越快，因此降低活化能会有效地促进能越低，反应速率越快，因此降低活化能会有效地促进反应的进行。反应的进行。T T：绝对温度（绝对温度（K K），），T T（K K）t t()+273()+273 R R：气体常数气体常数(8.318.31 J/mol K)J/mol K)e:e:2.718 2.718 因：t=1/K*ln(N0/Ns)故：t=eE/RT*1/A*ln(N0/Ns)3与K有关的表示方法：D D（1/101/10衰减时间）衰减时间）decimal reaction timedecimal reaction time：活活微微生生物物在在受受热热过过程程中中减减少少到到原原来来数数目目的的1/101/10所所需需要的时间。要的时间。与与K K的关系为：的关系为：D D =ln(0.1Nln(0.1N0 0/N/N0 0)/K)/K =2.303 lg0.1/K2.303 lg0.1/K =2.303/K=2.303/Kl l灭菌标准：以杀死耐热芽孢杆菌为准：Es=68700 cal/mol.k,As=7.941038(s-1)即:K=7.941038 e-68700/1.98T 三 营养受热分解规律 符合微生物热死亡动力学规律和Arrhenius方程：l ldC/dt=K C 可变形为：ln(Cs/Co)=Kt 或 Cs=C0eKtl lK=AeE/RT KK：营营养养成成分分受受热热分分解解速速率率常常数数（minmin1,1,s s1 1）EE：营养成分受热分解反应的活化能（营养成分受热分解反应的活化能（J/molJ/mol）l l 化学反应动力学：化学反应动力学：活化能大的反应，反应速度随温度的变化也活化能大的反应，反应速度随温度的变化也大；反之，反应速度随温度的变化也小。大；反之，反应速度随温度的变化也小。注：微生物受热死亡的活化能注：微生物受热死亡的活化能EE比营养成分受热分解的活化能比营养成分受热分解的活化能EE大。大。EE大，说明反应速率随温度变化也大；当温度升高，大，说明反应速率随温度变化也大；当温度升高，微生物死亡速度比营养成分分解速度快。微生物死亡速度比营养成分分解速度快。微生物微生物 活化能活化能（J/molJ/mol）营养物营养物活化能活化能 （J/molJ/mol）嗜热芽孢杆菌嗜热芽孢杆菌 283460 283460 葡萄糖葡萄糖 100488100488肉毒杆菌肉毒杆菌 343300 343300 维生素维生素B1 B1 92114 92114 当温度升高，微生物死亡速度比营养成分分解速度快。故采取故采取高温瞬时高温瞬时，有利于快速杀灭菌体，而且减少营养，有利于快速杀灭菌体，而且减少营养的破坏。的破坏。例题：1.1.若温度从120升至150，分别计算120和150 下的VB1的分解速率常数KB和嗜热芽孢杆菌的比死亡速率常数Ks；并比较 KB150/KB120;Ks150/Ks120，反映何种规律。已知EB1=92114J/mol,AB1=9.301010（min-1）;Es=284460J/mol,As=1.341036(min-1)2.在120下灭菌7.6min，计算此时VC的损失率。(120下，若Kc 0.055min1)l问题：为何工业上采用高温瞬时的灭菌方式？l l 上上节课节课重点内容小重点内容小结结培养基灭菌程度N/N0l l培养基灭菌程度的要求因发酵系统而异。某些培养过程，由于培养基中的基质不易被一般微生物利用,或温度、pH不适于一般微生物的生长，则对无菌程度要求低；但是有一些培养过程对无菌程度要求高，例如抗生素的生产过程。第一节分批灭菌l l一、微生物的热死灭动力学一、微生物的热死灭动力学 对对培培养养基基进进行行湿湿热热灭灭菌菌时时，培培养养基基中中的的微微生生物物受受热热死死亡亡（微微生生物物体体内内蛋蛋白白质质变变性性）的的速速率率与残存的微生物数量成正比。与残存的微生物数量成正比。ln(N/N0)=-Kt均相系统，它符合化学反应的一级反应动力学。K（比热死亡速率常数）由两个因素均定1、微生物的种类2、灭菌温度。ln(N/N0)=-K t ln(C/C0)=-Kd t杂菌营养物质T ，K，Kd也就是K对T的变化率是怎么样的？灭菌动力学的重要结论 细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分营养物质热破坏反应的E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N0)=-K t）；由于营养成分热破坏的E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。第三节 分批灭菌 培养基和发酵罐同时灭菌，冷却至发酵温度再接种发酵。又称间歇灭菌或实罐灭菌（实消）。一一 分批灭菌分批灭菌分批灭菌的特点：分批灭菌的特点：适用于：培养基易发泡或黏度大优点：操作简便，无需连消的设备，并减少了 杂菌污染的机会缺点：升温降温时间长，设备利用率低第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计1 1、分批灭菌的操作、分批灭菌的操作 将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备一起进行灭菌，也称实将培养基和所用的设备一起进行灭菌，也称实罐灭菌。罐灭菌。优点：优点：（1 1）不需专门的灭菌设备。不需专门的灭菌设备。（2 2）对蒸汽的压力要求较低，在）对蒸汽的压力要求较低，在3 34104105 5PaPa（表压）就可满足要求。表压）就可满足要求。缺点：在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅缺点：在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。炉负荷波动大。The Autoclave高压蒸汽锅第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l2、分批灭菌的设计l l要求绝对的无菌在工业上很难做到，l l因为：N=0，则e-kt=0,1/ekt=0,ekt=,t=因此，绝对的无菌很难做到。第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l 而且绝对的无菌也是不必要的，工程上只要求培养基中杂菌降低到合理的程度，然后进行细胞的培养，失败的可能性很小。l l 那么无菌程度降低到多少为好呢？l l 有一个设计标准（判据）N0：未灭菌培养基的含菌数。N：灭菌后培养基中存活的菌体数，第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l常取N=10-3个/罐。l l它的意义是：灭菌103次，存活一个活菌孢子的机会为1次。l l例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐=那么为计算方便 Ln（N0/N）=36.8 第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0Ln(N0/N1)Ln(N2/N)Ln(N1/N2)Ln N0/N=36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的ln（N0/N）=ln（）ln N0/N=ln+ln+ln第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l在灭菌过程中，必需设计出灭菌过程的操作时间和温度。l首先根据培养过程对培养基无菌程度的要求提出无菌判据（ln），然后依据所使用的灭菌设备，和设计出的灭菌温度和时间来计算出实际的ln，看能否达到开始提出的无菌要求。l llnln(N(N0 0/N/N1 1)=)=K K(t(t1 1-t-t0 0)l lK K是变数，是变数，t t变化，变化，T T变化，变化，K K也变化。也变化。升温段：T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/N)ln(N0/N1)T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/N)保温段：Ln(N1/N2)=K(t2-t1)T一定，K是常数。ln(N1/N2)降温段：这三个判据中，保温段可以算出，升温段和降温段不好办，因为不知道T和t之间的函数关系。l l是否有这样的函数关系呢？l l一些学者已经作出的常用的换热方式T-t关系式。l l除了这种积分方式以外，工程上还常用图解积分法，即从设计的T-t数据换算成K-t数据，进行图解积分。第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l例例如如：某某发发酵酵罐罐分分批批灭灭菌菌最最高高温温度度120120，保保持持5 5minmin，设设计的温度和时间关系如下：计的温度和时间关系如下：l l（A=7.9410A=7.94103838minmin-1-1；E=278441J/mol;R=8.28J/molKE=278441J/mol;R=8.28J/molK）t0103036435055586370102120140T30509010011012012011010090604433K0000.030.363.593.590.360.03000t：min,T:,K:min-1,发酵罐60m3，N0=105个/ml，N=10-3问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l l解：先计算无菌程度的判据：l l N N0 0/N/N=61015l lln(N N0 0/N/N)=36.3l lK的数据值是由已知数据计算出的l l根据已有的数据作出T-t和K-t图ln(N0/N3)=ln(N0/N1)+ln(N1/N2)+ln(N2/N3)=36.3 ln(N1/N2)=Kt=3.595=17.95 第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计l lln(N0/N1)+ln(N2/N3)按图解积分，求得:l lln(N0/N1)+ln(N2/N3)=15.85 l lln(N0/N3)=l lt=34min以前和t=64min以后，K值太小，忽略不计.l l没有达到N3=10-3的要求,l l残留菌数N3=N0e-Kt=N0 e-33.8=1.2610-2第一节分批灭菌二 分批灭菌的设计保温阶段对杀死孢子的贡献保温阶段对杀死孢子的贡献:17.95/33.8=53%17.95/33.8=53%，而保温阶段时间只有，而保温阶段时间只有5 5minmin。那么如何改进设计呢？那么如何改进设计呢？(1)(1)增加保温时间，如果增加增加保温时间，如果增加1 1min,min,那么那么lnln (N1/N2)=3.596=21.54=3.596=21.54 那么那么lnln(N N0 0/N/N3)3)=21.54+15.85=38.39=21.54+15.85=38.39，达到了设计要求。达到了设计要求。(2)(2)可以提高灭菌温度。可以提高灭菌温度。间间歇歇灭灭菌菌的的提提温温阶阶段段和和降降温温阶阶段段对对灭灭菌菌的的贡贡献献相相对对较较小小，而而对对培培养养基基中中维维生生素素类类物物质质的的破破坏坏作作用用则则可能很严重。应尽量缩短提温和降温阶段。可能很严重。应尽量缩短提温和降温阶段。一 灭菌效果(灭菌准数、灭菌值）当灭菌当灭菌温度恒定温度恒定下下，培养基中微生物死亡遵循培养基中微生物死亡遵循：lnN lnN0 0/N/Ns=ktkt 当当温度温度随时间变化时，随时间变化时，K K也变化也变化：积分得积分得 ln(Nln(No o/N/Ns)=A)=A 升温、维持和冷却过程的灭菌效果为：V总=ln(No/Ns)V加+V保 V冷 V加ln(No/N1)AV保ln(N1/N2)K（t2-t1）V冷ln(N2/Ns)A
