厌氧微生物及其在环境工程中的作用分类与研究 .doc

厌氧微生物及其在环境工程中的作用分类与研究摘要厌氧微生物是整个微生物世界的一个重要组成部分。近二十多年随着厌氧操作技术的不断完善，厌氧微生物研究方法的不断改进，尤其近十多年来许多新技术和方法的应用，致使厌氧微生物学取得很大的进展，获得了丰硕的成果。厌氧微生物在各方面的应用所进行的广泛而深人的研究，也开阔了人们对丰富多彩的厌氧微生物世界的认识，揭示了厌氧微生物广阔的应用前景。厌氧微生物涉及面广，本文就三种厌氧微生物（产甲烷菌，厌氧氨氧化菌，硫酸盐还原菌）进行了在环境工程中的作用分类与研究进行探讨。产甲烷菌在自然界中的种类和生态类群是相当丰富的，随着厌氧培养技术和分子生物学技术的不断发展，人们对产甲烷菌这一独特类群的研究将更加细致和全面。产甲烷菌由于具有独特的代谢机制，所以必将在环境和能源工业领域发挥重要的作用。厌氧氨氧化可同时去除氨氮和亚硝氮,在环境工程上具有重大开发价值.厌氧氨氧化菌种类丰富, 经过长期培养,厌氧消化污泥可呈现硫酸盐型厌氧氨氧化活性,这为新型生物脱氮工艺的研发打下了基础。硫酸盐还原菌处理废水的理论在国内外处于热点研究探索中，又由于硫酸盐还原菌容易培养等一系列优点，使其在工程上的应用成为可能。关键词：厌氧微生物，产甲烷菌，厌氧氨氧化菌，硫酸盐还原菌，环境目录摘要I1 研究背景12 研究方法及内容321 厌氧微生物介绍322 厌氧微生物的分类323 厌氧微生物的分类及其在生物系统发育中的地位33 研究结果531 产甲烷菌5311 产甲烷菌的分类5312 产甲烷菌的生态多样性6313 产甲烷菌在厌氧生物处理中的应用732 厌氧氨氧化菌8321 厌氧氨氧化菌的分类8322厌氧氨氧化菌的应用1333 硫酸盐还原菌14331 硫酸盐还原菌及其分类14332 硫酸盐还原菌的培养和分离15333 硫酸盐还原菌的代谢机理16334 硫酸盐还原菌去除硫酸盐废水中重金属的机理17335 硫酸盐还原菌处理废水的研究174 研究未来预测2141 产甲烷菌2142 厌氧氨氧化菌2143 硫酸盐还原菌215 本人评述及本人拟定研究计划23参考文献251 研究背景自然界的生物种类繁多、性状各异、功能当然也相差甚远。人类在不断探索利用自然界的各种生物为自身谋福利。至今为止人类的衣、食、住、行等方面都利用了生物，在环境保护方面也很好地利用了生物。但是我们还有很多生物没有很好地利用，也有很多领域生物的自然优势没有被充分地利用。尤其在利用生物进行环境保护方面更需要我们大胆地去探索。由于人口的快速增长，自然资源的大量消耗，全球的环境状况急剧恶化、水资源短缺、土地沙漠化、酸雨肆虐、森林减少、物种灭绝等等。人类的生存和发展面临严峻的挑战，迫使人类进行一场“环境革命”以拯救人类自身。在这场环境革命中，环境生物技术的兴起和发展具有十分重要的意义，并且成为了具有核心作用的、安全可靠的、行之有效的技术和手段。厌氧微生物是整个微生物世界的一个重要组成部分。厌氧微生物绝大多数为细菌，很少数是放线菌，极少数是枝原体，厌氧真菌尚见于个别的报道。厌氧微生物在自然界分布广泛。人类生活的环境和人体本身就生存有种类众多的厌氧微生物， 它们与人类的关系密切。然而由于厌氧微生物的分离和纯种培养的困难， 研究厌氧微生物的技术和方法进展又相当缓慢，致使人类对厌氧微生物的认识和利用远远落后于对好氧和兼性厌氧微生物的研究工作。直到近二十多年随着厌氧操作技术的不断完善，厌氧微生物研究方法的不断改进，尤其近十多年来许多新技术和方法的应用，致使厌氧微生物学取得很大的进展，获得了丰硕的成果。发现了众多种类的厌氧微生物，它们在自然界不仅生存于一般的常温的无氧和少氧环境中，最近尚发现有生存于高温环境最适生长温度为100一103甚至有高达105的超嗜热专性厌氧细菌，亦发现有能生长在南极的嗜冷厌氧菌，尚发现有能在22一25%盐浓度中生长的专性厌氧发酵的嗜盐菌1。随着涌现出众多的新目、新属和新种，某些已知的属种分类位置也有很大变动。尤其是现已明确厌氧微生物在生物进化中系统发育的特殊地位更显示出它们的重要性。厌氧微生物可利用的基质极为广泛， 包括了自然界各种各样含氮和不含氮的有机物及CO2等。它们在氮和碳等元素地球生物化学大循环中起着很重要的作用。厌氧微生物在各方面的应用所进行的广泛而深人的研究，也开阔了人们对丰富多彩的厌氧微生物世界的认识，揭示了厌氧微生物广阔的应用前景。厌氧微生物涉及面广，本文就三种厌氧微生物（产甲烷菌，厌氧氨氧化菌，硫酸盐还原菌）在环境工程中的作用分类与研究进行探讨。2 研究方法及内容21 厌氧微生物介绍厌氧微生物尚无公认的确切定义，但通常认为这是一类只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气（18%氧气）和（或）10二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的微生物。按其对氧的耐受程度的不同，可分为专性厌氧微生物、微需氧厌氧微生物和兼性厌氧微生物。22 厌氧微生物的分类根据对O2的耐受程度，可将厌氧微生物分为3大类：（1）对氧极端敏感的厌氧微生物：代表菌种为月形单胞菌。这类细菌对厌氧条件要求很高，在空气中暴露10min即死亡，临床上很难分离出；（2）中度厌氧微生物：代表菌种为脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌等临床分离常见的厌氧菌。它们在空气中暴露6090min或在脓汁抽出72h后仍然能分离出来；（3）耐氧厌氧微生物：代表菌种为溶组织梭菌。这类细菌不能利用氧，在无氧条件下生长好，而在有氧条件下生长不佳。23 厌氧微生物的分类及其在生物系统发育中的地位厌氧微生物中绝大多数是细菌，很少数为放线菌，极少数是枝原体，个别的属于真菌。目前所知有研究者从动物的瘤胃中分离到着生鞭毛的属于藻状菌纲（phycomycetes）的厌氧真菌。也有极个别报道厌氧消化器中也存在有厌氧真菌。支原体（mycoplasma）这一俗名是指在表型上比一般细菌小，缺乏细胞壁的一大群原核生物。因其特征分类学上将其置于柔膜菌纲。厌氧的支原体发现于牛羊的瘤胃内，原作为柔膜菌纲下的一个属。从营养、生化、血清和基因组的资料分析，表明厌氧支原体与兼性厌氧的支原体不相同。在分类上现已将它们升为“目”的位置厌氧原体目。其主要的科属列如下：厌氧原体目（Anaeroplasmatales）厌氧原体科 (Anaeroplasmaceae)厌氧枝原体属 (Anaeroplasma)无幽醇枝原体属 (Asteroleplasma)Woese氏实验室于1976年开始应用16SrRNA寡核昔酸序列分析法对微生物中有代表性的60个种进行了实验，发现其中产甲烷细菌与其它类群菌明显不一。以后他们又扩大了研究范围，也使更多的研究者应用这一方法寻求在微生物世界建立一个自然发育系统，也导至了古细菌界的建立阁。Woese的论述中又概括了大量的研究资料，绘制了原核生物和真核生物的16SrRNA寡核昔酸的序列谱。经分析比较古细菌、真细菌和真核生物按其综合系数各自成为一群。古细菌与典型的真细菌不同之处还显示出它们具有独特的细胞结构和特有的辅酶等性状。它们既不能归属于真核生物，也不属原核生物，而是构成一个新的古细菌分支。研究结果表明在自然系统发育史上生命是按遗传的三条干线即古细菌、真细菌和真核生物进化的。三条干线的发源根基来自一个共同的祖先，而古细菌离共同的祖先较之真细菌和真核生物要近得多。古细菌包括专性厌氧的产甲烷细菌、极端嗜盐细菌和嗜酸嗜热细菌。它们生存的环境正是生命起源的环境条件。这与地球曾是厌氧的和生命开始出现于厌氧时期的理论是相吻合的。微生物是整个生物界起源最早的生物，而厌氧微生物是地球处于厌氧状况下发展起来的最早生命体。好氧菌是地球逐渐积累有氧的条件下由部分厌氧菌长期地适应环境进化而来的。为了研究微生物在进化中的关系，探索生命起源的源头，构建生物界完整的系统发育图谱，很显然对厌氧微生物的研究占有极重要的地位，其意义也是重大的。3 研究结果本文就三种厌氧微生物（产甲烷菌，厌氧氨氧化菌，硫酸盐还原菌）在环境工程中的作用分类与研究进行探讨。31 产甲烷菌产甲烷菌是一类严格厌氧的原核微生物，是有机物甲烷化作用中食物链的最后一组成员，其独特的厌氧代谢机制使其在自然界物质循环中起着重要作用。一方面，产甲烷菌是产生温室气体的主要因素，全球甲烷的排放量每年大约是500 t，其中74%是由产甲烷菌代谢产生的2；另一方面，产甲烷菌在有机质的厌氧生物处理工业应用中发挥着关键的作用，如沼气发酵、煤层气开发等。因此，对产甲烷菌的研究具有重要的理论和实践意义。311 产甲烷菌的分类1776年，Alessandro Volta首次发现了湖底的沉积物能产生甲烷，之后历经一个多世纪的研究，利用有机物产甲烷的厌氧微生物才大致被分为两类：一类是产氢、产乙酸菌，另一类就是产甲烷菌。W.E. Balch等在1979年报道了3个目、4个科、7个属和13个种的产甲烷微生物，他们的分类是建立在形态学、生理学等传统分类特征以及16SrRNA寡核苷酸序列等分子特征基础上的3，随着厌氧培养技术和菌种鉴定技术的不断成熟，产甲烷菌的系统分类也在不断完善。伯杰系统细菌学手册第9版将近年来的研究成果进行了总结和肯定，并建立了以系统发育为主的产甲烷菌最新分类系统。产甲烷菌分可为5个大目，分别是：甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目( Methanococcales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)4，上述5个目的产甲烷菌可继续分为10个科与31个属，它们的系统分类及主要代谢生理特性见表1。目前研究产甲烷菌各级分类单元最有效的手段是多相分类(Polyphasic taxonomy) 5，该方法能较为客观、全面地反映产甲烷菌各个分类单元在自然系统进化中的地位，涉及的数据包括表型类、基因型类和系统发育标记类。其中表型信息主要是指形态和生理生化性状的分析；基因信息包括分子杂交(DNA-DNA分子杂交、DNA-rRNA分子杂交等)和分子标记(RFLP、SSCP等)；系统发育信息则主要是指16S rDNA的序列分析。利用全面系统的分类鉴定技术可以发现自然界中更多新的产甲烷菌类群，从而丰富产甲烷菌的分类地位。表1 产甲烷菌系统分类的主要类群及其生理特性分类单元(目)典型属主要代谢底物典型栖息地甲烷杆菌目Methanobacterium，Methanobrevibacter，Methanosphaera，Methanothermobacter，Methanothermus氢气和二氧化碳，甲酸盐，甲醇厌氧消化反应器，瘤胃，水稻土壤，腐败木质，厌氧活性污泥等甲烷球菌目Methanococcus，Methanothermococcus，Methanocaldococcus， Methanotorris氢气和二氧化碳，甲酸盐海底沉积物、温泉等甲烷微菌目Methanomicrobium， Methanoculleus，Methanofollis， Methanogenium，Methanolacinia， Methanoplanus，Methanospirillum，Methanocorpusculum，Methanocalculus氢气和二氧化碳，2-丙醇，2-丁醇，乙酸盐，2-丁酮厌氧消化反应器、土壤、海底沉积物、温泉、腐败木质、厌氧活性污泥等甲烷八叠球菌目Methanosarcina， Methanococcoides，Methanohalobium， Methanohalophilus，Methanolobus， Methanomethylovorans，Methanimicrococcus， Methanosalsum，Methanosaeta氢气和二氧化碳，甲酸盐，乙酸盐，甲胺高盐海底沉积物、厌氧消化反应器、动物胃肠道等甲烷火菌目Methanopyrus氢气和二氧化碳海底沉积物312 产甲烷菌的生态多样性产甲烷菌属于原核生物中的古菌域，具有其它细菌如好氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌所不同的代谢特征。产甲烷菌的甲烷生物合成途径主要是以乙酸、H2/CO2、甲基化合物为原料6。产甲烷菌在自然界中分布极为广泛，在与氧气隔绝的环境几乎都有甲烷细菌生长，如海底沉积物、河湖淤泥、水稻田以及动物的消化道等。在不同的生态环境下，产甲烷菌的群落组成有较大的差异性，并且其代谢方式也随着不同的微环境而体现出多样性。313 产甲烷菌在厌氧生物处理中的应用产甲烷菌具有独特的代谢机制，能使农业有机废物、污水等环境中其它微生物降解有机物降解后产生的乙酸、甲酸、H2和CO2等转换为甲烷，既可生产清洁能源，又可实现污水中污染物减量化；同时，其代谢产物对病原菌和病虫卵具有抑制和杀伤作用，可实现农业生产、生活污水无害化。因此，产甲烷菌及其厌氧生物处理工艺技术在工农业有机废水和城镇生活污水处理方面具有广阔的应用前景。厌氧生物处理生成甲烷一般需要3类微生物的共同作用，而最后一步由产甲烷菌微生物完成的甲烷生成则是限速步骤。高活性的产甲烷菌是高效率的厌氧消化反应的保证，同时也可以避免积累氢气和短链脂肪酸。当然，这一限速步骤也容易受到菌体活性、pH和化学抑制剂等多种因素的影响.在厌氧消化反应器中目前研究较多的是Methanosaeta和Methanosarcina这两种乙酸营养产甲烷菌. Methanosaeta具有较低的生长速率和较高的乙酸转化率；而Methanosarcina具有相对高的生长速率和低的乙酸转化率。这两种类群数量不仅受控于作为底物的乙酸的浓度，也受控于其他营养物的浓度7 。在工业应用中，Methanosaeta在高进液量、快流动性的反应器(如UASB)中使用广泛，可能与它们具有较高的吸附能力和颗粒化能力有关。而Methanosarcina对于液体流动则很敏感，所以主要用于固定和搅动的罐反应器。温度和pH是影响厌氧反应器效率的两个重要参数。对于温度而言，一般的中温条件有助于厌氧反应的进行并同时减少滞留时间。在高温厌氧消化器中常见的氢营养产甲烷菌主要是甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)，它们的厌氧消化能力一般是随着温度的升高而增强，但过高的温度会使其受到抑制8。因此为保证厌氧消化的顺利进行，一般需要选择合适的温度。对于pH来说，大多数产甲烷菌的最适生长pH是中性略偏碱性，但一般增大进料速率会导致脂肪酸浓度的增大，从而导致pH降低，因此耐酸的产甲烷菌可以提高厌氧反应器的稳定性。Savant等从酸性厌氧消化反应器中分离到一株产甲烷菌(Methanobrevibacteracididurans)，其最适pH略偏酸性9，向厌氧消化反应器加入该产甲烷菌可以有效增加甲烷的产生量，减少脂肪酸的积累。32 厌氧氨氧化菌1977年Broda指出，化能自养细菌能以NO3-、CO2和NO2-氧化为N2。推测自界可能存在以NO-2为电子受体的厌氧氨氧化反应。后来有研究发现氨氧化菌Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas eutropha能同时硝化与反硝化，利用NH2OH还原NO2-或NO2，或者在缺氧条件下利用NH4+作为电子供体，把NH4+转化为N2在利用NO2为电子受体时，其厌氧氨氧化的最大速率(以单位蛋白质计)约为2nmol(min·mg)。然而在反硝化的小试实验中发现了一种特殊自养菌的优势微生物群体，它以NO2-为电子受体，最大比氨氧化速率(以单位蛋白质计)为55nmol/ (min·mg) 此反应比Nitrosomonas快25倍，把这种细菌称为厌氧氨氧化菌10。在无分子氧环境中，同时存在NH4+和NO2-时，NH4+作为反硝化的无机电子供体，NO2-作为电子受体，生成氮气，这一过程称为厌氧氨氧化。近年来，在厌氧氨氧化菌生理生化特性的理论研究领域和废水生物脱氮的应用研究领域都有了许多新的发现，这对于全面认识厌氧氨氧化菌的性质、开发新的废水脱氮技术都具有重要意义。321 厌氧氨氧化菌的分类1浮霉状菌11浮霉状菌的种类浮霉状菌目(Planctomycetales)是细菌域中分化较早的一个分支，该目包括浮霉状菌科(Planctomyc-etaceae)和厌氧氨氧化菌科(Anammoxaceae)。厌氧氨氧化菌科包含5个属9个种，皆为厌氧性化能自养菌，并具有厌氧氨氧化功能。本文所述的浮霉状菌是厌氧氨氧化菌科的细菌。具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌最早发现于流化床反应器中11，但迄今未获纯培养。对浮霉状菌的鉴定，主要以分子生物学手段进行文献报道的厌氧氨氧化菌共有9种:Candidatus brocadia anammox-idans、Candidatus Brocadia fulgida、CandidatusKuenenia stuttgartiensis、Candidatus Scalindua bro-dae、Candidatus Scalindua wagneri、CandidatusAnammoxoglobus propionicus、Candidatus Jetteniaasiatica、Candidatus Anammoxoglobus sulfate和CandidatusScalindua sorokinii其中，前8种厌氧氨氧化菌分离自污水处理厂构筑物或实验室反应器样品。后1种分离自海水样品。12浮霉状菌的特性121营养特性浮霉状菌为化能自养型细菌3，以CO2为唯一碳源，通过将亚硝酸氧化成硝酸来获得能量，并通过乙酰-CoA途径同化CO212。若用CH2O表示细胞物质，厌氧氨氧化反应可如下表示：NH4+1.31NO2-+0.0425CO21.045N2+0.22NO3-+1.87H2O+0.09OH-+0.0425CH2O (1)虽然有的厌氧氨氧化菌能够转化丙酸、乙酸等有机物质，但这些厌氧氨氧化菌不能将有机物质用作碳源13，厌氧氨氧化菌对氨和亚硝酸的亲和力常数都低于10-4gN·L-1，基质浓度过高会抑制厌氧氨氧化菌活性 （表2）。厌氧氨氧化菌的基质谱较窄，一般只限于氨及其代谢中间产物(羟胺和联氨)。表2 基质对厌氧氨氧化菌的抑制浓度基质抑制浓度（mmol·L-1）半抑制浓度（mmol·L-1）氨氮7055亚硝氮725122生态分布厌氧氨氧化反应最初发现于脱氮流化床反应器中.Kuypers等14研究证实黑海中存在厌氧氨氧化作用，并且推断厌氧氨氧化反应对海洋的氮素循环起着重要作用；Dalsgard等15报道在哥斯达黎加杜尔塞湾的厌氧水体中，可通过厌氧氨氧化反应产生氮气。废水生物处理系统是厌氧氨氧化菌的理想生境。Toh等20研究发现，在处理焦炉废水的生物反应器中存在厌氧氨氧化作用，氨随废水大量进入，氧受限制时只能产生亚硝酸盐，使厌氧氨氧化反应极易发生。发生厌氧氨氧化反应的前提条件是氨和亚硝酸盐同时存在，且不存在氧。在自然生态系统中，由于氧供应不足或电子供体有限，常常发生氨氧化成亚硝酸盐或硝酸盐还原成亚硝酸盐的情况。在湖泊底泥的好氧、缺氧界面上，氨和亚硝酸常常共存，是厌氧氨氧化菌的良好生境。2 亚硝酸细菌21亚硝酸细菌的种类能够将氨氧化为亚硝酸盐的细菌被称为亚硝酸细菌。亚硝酸细菌包含3个属，即Nitrosomonas、Nitrosococcus和Nitrosospira。经过检测，已发现Ni-trosomonas属中N. europaea、N. eutropha、N. halo-phila3个种以及其他一些菌株具有厌氧氨氧化能力16。在Nitrosococcus和Nitrosospira属中是否也存在具有厌氧氨氧化能力的种类，还有待进一步研究探明。22亚硝酸细菌的特性221厌氧氨氧化活性长期以来，亚硝酸细菌一直被认为是典型的好氧自养菌，其生理特征是以氧为电子受体，把氨氧化为亚硝酸盐，从中获得能量，同化CO2合成细胞物质而生长。但是，近期研究发现，一些亚硝酸细菌除了能够利用氧作为电子受体外，也能利用亚硝酸盐、NO、NO2作为电子受体，将氨氧化为N2，这些亚硝酸细菌具有厌氧氨氧化能力23-25据文献报道23，N europaea含有氨单加氧酶和羟胺氧还酶，在有氧条件下，能将氨氧化成为亚硝酸盐(即NH4+NO2-)；该菌也含有亚硝酸盐还原酶和氧化亚氮还原酶，在氧受限制或无氧条件下，能将亚硝酸盐还原成N2O和N2(即NO2-N2O、N2)。在N europaea的作用下，通过硝化和反硝化作用，大约7%的氨氮被转化为N2。有氧时，N. eutropha能以氧为电子受体进行硝化作用，将NH4+-N转化成NO2N；无氧时，则能以NO2为电子受体进行厌氧氨氧化作用24。由于25时大约70%NO2以二聚物N2O4的形式存在，推测N2O4是氨的直接氧化剂17。有氧条件下，N. halophila进行自养生长，能够以氨作为唯一能源同化CO2，最大氨氧化速率为9.83 mg·L-1·d-1；无氧条件下，该菌进行厌氧氨氧化，最大氨氧化速率为0.77 mg·L-1·d-1，最大亚硝酸还原速率为0.93 mg·L-1·d-1，氨和亚硝酸的转化比率为11.21.。经过15 d的培养，N. halophila可将一半基质(NH4+-N和NO2-N)转化为氮气 25。但该菌不能在无氧条件下利用氨和亚硝酸作为基质生长，40d培养后，其细胞解体(图1)。 图1 厌氧培养前后N. halophila的内部结构222生态分布亚硝酸细菌分布广泛，可存在于水体、土壤、污水池等各种自然和人工环境中。Phil-lips等18从西北地中海地区取样，比较研究了附着和浮游-Proteobacteria氨氧化菌的种群结构，结果表明，附着氨氧化菌以Nitrosomonas为优势菌，而浮游氨氧化菌则以Nitrosospira为优势菌。淡水养鱼池(水族箱)中检出的亚硝酸细菌与Nitrosomonasma-rine、N. europaea和Nitrosococcusmobilis关系密切其中，N. marine硝化效率较高19,20.在海水养鱼池中，亚硝酸细菌N.europaea及其近缘种所占的比例较大，硝酸细菌Nitrobacter winogradskyi低于检测限21。在3种沉积土壤(变质岩、沉积岩、花岗岩)中， 10 cm土深处的亚硝酸细菌数量分别为1.30×107、6.27×108、7.40×108cfu·g-1DM， 100 cm土深处分别为1.10×107、7.20×105、1.09×107cfu·g-1DM34.陈岭等22采用PCR技术研究了硝化池中氨氧化菌amoA基因的多样性，认为N. europaea是污水处理系统中的主要氨氧化菌。Liu等23研究表明，在生物转盘的脱氮菌群中，Nitrosomonas和Planctomycetales分别占10%和70%。3反硝化细菌31反硝化细菌的种类能够使硝酸盐和亚硝酸盐还原成氮气的细菌被称为反硝化细菌。在分类学上，与硝化细菌不同，反硝化细菌没有专门的类群，各物种分散于原核生物的众多属中。包含反硝化细菌的属绝大多数归入真细菌域，少数归入古生菌域。大多数反硝化细菌是兼性厌氧菌，能够利用氧或硝酸盐作为最终电子受体，有氧时进行好氧呼吸，无氧时进行硝酸盐呼吸。也有一些反硝化细菌是严格厌氧菌，氧的存在会对其产生毒害作用。32反硝化细菌的特性321营养特性反硝化细菌种类繁多，既有自养型细菌，也有异养型细菌和兼营养型细菌。自养型反硝化细菌可利用氢、氨、硫、硫化氢和铁等无机物质作为电子供体，该类细菌严格化能自养，不能通过氧化有机物获得能量。其中，对以利用硫的自养型反硝化细菌的研究较多，主要有Thiobacillus denitrificans和Thiomicrospira denitrificans24。T. denitrificans利用单质硫为电子供体所进行的反硝化作用如下：5S+6KNO3+2H2OK2SO4+3N2+4KHSO4(2)异养型反硝化细菌可利用有机质作为电子供体进行反硝化作用.Hyphomicrobium菌株以甲醇为电子供体的反硝化作用如下：6NO3-+5CH3OH5CO2+3N2+7H2O +6OH-(3)兼营养型反硝化细菌既能自养生长，也能异养生长。这类反硝化细菌主要包括Thiobacillus versu-tus、Thiobacillus thyasiris、Thiosphaera pantotropha和Paracoccus dentrificans等25，它们对环境有更强的适应性。322厌氧氨氧化活性在反硝化细菌中，已发现Pseudomonasmendocina具有厌氧氨氧化能力26。P.mendocina为杆菌，大小0.4-0.6m×1.4-1.8m单极生鞭毛。P. mendocina具有反硝化活性，在有机反硝化培养基中，最大硝酸盐还原速率为14.96 mg·L-1·d-1。该菌也具有厌氧氨氧化活性，在厌氧条件下，它能同时转化氨与硝酸盐，最大硝酸盐转化速率和最大氨氮转化速率分别为6.373和3.344mg·L-1·d-1，消耗的氨氮和硝酸盐之比为11.9127。323生态分布反硝化细菌广泛分布于各类自然生境中。Hauck等对深湖底泥中的反硝化细菌作了计数，结果为1.0×1062.1×108cells·ml-1，其中以上层底泥中的反硝化细菌数量最大.。Mergel等对森林土壤中反硝化细菌的检测结果表明，土壤表层(<5 cm)的反硝化细菌数量最大。Chèneby等采用16S rRNA技术研究了3种耕种土壤中反硝化细菌的数量特性，结果表明，2种淋溶土中反硝化细菌丰度分别为3×106和4×106ind·g-1DM，高于石灰土中的反硝化细菌丰度4×105ind·g-1 DM.Koenig等检测了废水处理系统中的反硝化细菌，结果表明在自养型脱硫反硝化生物膜中，T.denitrificans占整个菌群数量的32%。322厌氧氨氧化菌的应用1厌氧氨氧化工艺Mulder等在厌氧流化床中发现了厌氧氨氧化。后来，van de Graaf等和Bock等发现了以亚硝酸盐为电子受体的厌氧氨氧化过程28。郑平等研究了厌氧氨氧化菌混培物的动力学特性29。Fux Christian等进行中试试验研究，首先在连续搅拌反应器中完成亚硝化，58%的NH4+-N转化为NO2-；在SBR中完成厌氧氨氧化，除N速率为2.4 kgN/ (m3·d)，除N达90%；Sliekers等在gas lift reactor中发现除N速率达8.9 kgN/ (m3·d)，这个除N速率是实验室所获得的除N速率的20倍。Dapena-Mora等研究中发现在gas lift reactor中N负荷率为2.0 g/(L·d)，最大比厌氧氨氧化活性(MSAA)为0.9 g/ (g·d)。在SBR中N负荷率为0.75 g/ (L·d)，MSAA为0.4 g/ (g·d)，除NO2-达99%。2 SHARON-ANAMMOX联合工艺Jetten等30利用SHARON-ANAMMOX联合工艺对污泥消化出水进行了研究。SHARON反应器总氮负荷为0.8 kg/ (m3·d)，转化53%的总氮(39% NO2-，14% NO3-)，用SHARON反应器的出水作为厌氧氨氧化流化床反应器的进水，在限制NO2-的厌氧氨氧化反应器中NO2-全部被除去。试验中NH4+-N的去除率达83%。Van Dongen等应用SHARON-ANAMMOX联合工艺在工厂中长时间稳定运行。3 CANON (completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)工艺Dijkman和Strous描述了一个新的生物脱氮工艺CANON，在限氧条件下(<0·5%空气饱和度)得到了好氧和厌氧氨氧化菌的混培物，NH4+-N被需氧氨氧化菌(Nitrosomonas和Nitrososi-ra)氧化为亚硝酸盐，然后被厌氧氨氧化菌转化为氮气，此过程依赖于2种(Nitro-somonas需氧菌和Planctomycete厌氧氨氧化菌)自养微生物菌群的协同作用。CANON在2种不同的反应器(SBR和恒化器)中进行，容积负荷0.1 (kgN) /(m3·d)，除氮达92%。Sliekers等发现在限氧条件以及好氧氨氧化菌和厌氧氨氧化菌都有合适的负荷率时，SBR反应器中除N负荷率达0.3 (kg N) / (m3·d)，NH4+-N主要转化为N2(85% )，其余的转化为硝酸盐(15%)。Sliekers等31用gas lift reactor，除N负荷率达1.5 (kgN) / (m3·d)，这个速率是以前实验室获得的速率的20倍。Hao等32开发了在生物膜反应器中混合硝化(亚硝化+硝化)、厌氧氨氧化的数学模型，基于此模型评价了CANON过程的温度、流速。4 甲烷化与厌氧氨氧化耦合Jetten等通过污泥消化产甲烷除去COD，N部分氧化至NO2-，然后以NH4+为电子供体反硝化，实现了甲烷化和厌氧氨氧化。ZHANG运用EGSB反应器技术COD的去除率97%、NO2-去除率100%，容积负荷达6.56 gCOD/(L·d)和0.9 gN/ (L·d)，实现了甲烷化、反硝化与厌氧氨氧化的耦合32。33 硫酸盐还原菌硫酸盐还原菌( Sulp hate Reducing Bacteria简称SRB) 广泛存在于水田、湖、沼、河川底泥、石油矿床、地下管道、油气井、下水沟、一些工业废水(如造纸废水) 、反刍动物的第一胃等地方。SRB小，生长速度快，还含有不受氧毒害的酶系，因此可以在各种各样的环境中生存，保证了SRB 有较强的生存能力。目前我国的水污染十分严重，硫酸盐污染就是一种重要的组成部分，对硫酸盐污染的治理是一项十分迫切的任务。目前对待只含硫酸盐而不含COD 的废水主要采取非破坏性技术，如化学沉淀，电渗析，但这些方法很不经济，还容易产生二次污染。对待既含硫酸盐又含COD的废水主要采取破坏性的生物技术。因此SRB法作为一种很有潜力的治理硫酸盐污染的技术也就逐渐地成为研究的热点。331 硫酸盐还原菌及其分类SRB 通常是指能通过异化作用进行硫酸盐还原的一类细菌。一般来说，SRB 是一类形态，营养多样化的，利用硫酸盐作为有机物异化作用的电子受体的严格厌氧细菌。Delden于1903年发表了有关海水中耐盐菌种的报道，Eilon于1925年发现了一种嗜热的SRB。1930年，Barrs发表了一篇论文，较系统地讨论了SRB。现在人们已认识到SRB是严格厌氧菌，并发现其中有些菌种在无硫酸盐存在时仍能发酵获得能量而生长，但是所有的SRB都不能以氧作为电子受体。与普通的土壤或水体中的微生物如假单胞菌相比，SRB的生长速率相当缓慢，但是它们有顽强的生存能力，且分布广泛。在相当长的一段时间里，对SRB 的研究进展缓慢。20世纪70年代以前，确认的硫酸盐还原菌也只有脱硫弧菌( Desulf ovibrio)、脱硫肠状菌(Desulf otomaculum) 和脱硫单胞菌( Desulf omonas) 等3个属33 。在此之后，通过许多研究者的研究和成功分离，发现除了上述3个属外，SRB还存在着其它不同的属和种。1984年出版的第一版贝氏(Bergey)系统细菌学手册第一卷中，Nidel 和Pfenning 提出了SRB的属检索表，把所有的能还原硫酸盐或元素硫的细菌归为8个属：Desulf ovibrio；Desulf omonas；Desuulf obulbus；Desulf otomaculum；Desulf ococcus，Desulf obacter；Desulf osarcina；Desulf onema。此后，又有一些新属陆续被分离和命名。因此，据不完全统计，SRB已有12个属近40多个种34 。SRB的营养多样性水平相当高。根据废水中SRB可利用底物的不同，SRB又可分为4类35：一是氧化氢的硫酸盐还原菌( HSRB)；二是氧化乙酸的硫酸盐还原菌(ASRB)；三是氧化较高级脂肪酸的硫酸盐还原菌( FASRB)；四是氧化芳香族化合物的硫酸盐还原菌( PSRB)。当系统中SO42-不足时，这时SRB 内部将产生竞争。不同SRB将根据自身的动力学及力学特征优势(如对有机底物的使用情况)，而优先使用SO42-。SRB的有机底物与厌氧消化有紧密联系。通常将厌氧消化分为4个阶段：水解，发酵，产乙酸，产甲烷。而氢是第二、第三个阶段的重要产物，而对厌氧消化而言，正是氢气的产生与利用才保证了整个系统电位的降低使消化得以进行。 在没有SRB 的情况下，H2 的利用量由MPB (产甲烷菌) 承担。而高级脂肪酸(例如丙酸、丁酸、乳酸等) 是第二阶段的重要产物，在某些产酸菌的作用下，它们会被进一步的分解成为乙酸。据报道，厌氧消化中有70%的COD以这种形式而降解。而有30 %的COD经H2 的这种形式降解。332 硫酸盐还原菌的培养和分离以纯培养基培养SRB的先决条件之一是:环境的氧化还原电位( Eh) 必须在- 100 mV以下，这就意味着仅仅排尽空气对于SRB的生长是远远不够的，还必须加入氧化还原平衡剂，如一般用的Na2S。当接种物量大时，自身可以通过代谢产生H2S，但接种物量少时，必须通入H2S (通常用H2S来代替Na2S)。某些硫醇化合物如疏基酸钠可被脱硫弧菌或脱硫肠状菌利用，但疏基盐酸不能被其它属的SRB 利用。Na2S或连二亚硫酸钠可作为还原剂，如果某种接种物贮存大量的Na2S，那么一旦形成生长迅速的培养物，这些还原剂就能被释放出来。为达到鉴定的目的，在配制基质时，需加入约5%(质量比)的亚铁盐，当亚硫酸形成时就有黑色的FeS 沉淀产生，因此通常培养基变黑或者菌落四周有一个黑带边，就证明存在着硫酸盐还原菌。SRB大部分为中温性细菌，最适生长温度为30 ，还有些嗜热菌在55 下生长。因此，培养时要控制好SRB所需的温度。现有研究已经发现了有些SRB因自身含有不受氧毒害的酶系，使其在有少量氧存在时仍能生存。当环境为厌氧条件下，并且存在足够的SO42-时，SRB的代谢方式也会随之改变而转向产能水平较高的硫酸盐还原的代谢方式。而这个特点恰是SRB的一个优势，也是能形成对MPB产生初级抑制的一个原因所在。333 硫酸盐还原菌的代谢机理在富含硫酸盐的有水厌氧环境中，SRB是相当活跃的分子，它以硫酸盐作最终电子受体，分解水体中的有机物，获得合成细胞物质和维持生命所需的能。其代谢过程分为分解代谢、电子传递、氧化3个阶段，图2表明了这一过程的分解代谢、电子传递和SRB的关系。图2 SBR代谢机理在分解代谢的第一阶段，有机物碳源的降解是在厌氧状态下进行的，同时通过基质水平磷酸化产生少量ATP ；第二阶段中，前一阶段释放的高能电子通过SRB中特有的电子传递链(如黄素蛋白、细胞色素C等) 逐级传递， 产生