食品生物技术导论基因工程省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程FoodandGeneEngineering基因工程是生物工程关键基因工程是生物工程关键技术，是最具生命力和最技术，是最具生命力和最引人注目标前沿学科之一。引人注目标前沿学科之一。1 1第1页教学目标1 1、了解基因工程产生及发展、了解基因工程产生及发展2 2、掌握基因工程概念和特点、掌握基因工程概念和特点 3 3、掌握基因工程四大要素、掌握基因工程四大要素 4 4、掌握基因工程原理和过程、掌握基因工程原理和过程 5 5、了解基因工程在食品工业中应用、了解基因工程在食品工业中应用2第2页第一节第一节 基因工程概述基因工程概述一、基因及其发展简史一、基因及其发展简史二、基因工程涵义二、基因工程涵义三、基因工程普通步骤三、基因工程普通步骤3第3页1 1、基因概念、基因概念l基因基因是是DNA分子上含有遗传效应特分子上含有遗传效应特定核苷酸序列。定核苷酸序列。l指导人体内主要物质蛋白质等合成，指导人体内主要物质蛋白质等合成，维持着人体正常生理功效。假如一维持着人体正常生理功效。假如一个基因不正常，甚至基因中一个非个基因不正常，甚至基因中一个非常小片断不正常，就能够引发发育常小片断不正常，就能够引发发育异常、疾病，甚至死亡。异常、疾病，甚至死亡。基因是基因工程基因是基因工程操作对象操作对象4第4页基因（基因（gene）生命最大奥秘生命最大奥秘物质层面：物质层面：是是染色体上一段染色体上一段脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA）序列。）序列。功效层面：功效层面：是遗传信息载体，编码蛋白质和核糖核酸是遗传信息载体，编码蛋白质和核糖核酸（RNA）分子功效，调控基因表示。）分子功效，调控基因表示。基因基因1 1基因基因2 2DNA染色体染色体5第5页DNA结构结构戊糖戊糖磷酸磷酸单核苷酸单核苷酸碱基碱基脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸基经过基经过3,5磷酸磷酸二酯键连接形成二酯键连接形成螺旋链骨架螺旋链骨架6第6页3端端3端端5端端5端端磷酸二酯键磷酸二酯键7第7页碱基处于螺碱基处于螺旋内侧旋内侧8第8页1865孟德尔豌豆试验孟德尔豌豆试验l发觉了遗传规律：同对因子分离 异对因子自由组合 l首次提出了“遗传因子”（即基因）当代遗传学之父，奥地利生物学家格雷戈尔孟德尔 2 2、基因发展简史、基因发展简史9第9页19至至1928年摩尔根果蝇试验年摩尔根果蝇试验l深入证实了孟德尔因子和孟德尔定律l两大主要发觉：l基因是在染色体上，l遗传基因链锁和交换定律。即建立了作为摩尔根理论主要基础基因学说。美国遗传学家摩尔根 10第10页1953年最伟大模型年最伟大模型DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型l提出提出DNA右手双螺旋结构，在英国右手双螺旋结构，在英国自然自然杂志上发表了论文并杂志上发表了论文并1962年取得诺贝尔奖。年取得诺贝尔奖。l提出了提出了DNA复制机制复制机制即半保留复即半保留复制。制。美国生物化学家沃森（左一）英国生物物理学家克里克(左二）从分子水平揭示了种从分子水平揭示了种瓜得瓜，种豆得豆遗瓜得瓜，种豆得豆遗传机理传机理11第11页DNA半保留复制半保留复制lDNA复复制制时时每每个个子子代代DNA分分子子一一条条链链来来自自亲亲代代DNA，另另一条链是新合成，这种复制方式称半保留复制。一条链是新合成，这种复制方式称半保留复制。12第12页二、基因工程涵义二、基因工程涵义13第13页1、基因工程诞生基础、基因工程诞生基础（1）理论上三大发觉）理论上三大发觉l20世纪世纪40年代确定遗传信息携带者是年代确定遗传信息携带者是DNA而不是而不是蛋白质（蛋白质（肺炎双球菌转化试验肺炎双球菌转化试验）l50年代揭示年代揭示DNA分子双螺旋结构模型和半保留复分子双螺旋结构模型和半保留复制机制。制机制。l50年代末年代末60年代：年代：中心法则中心法则操纵子学说及遗操纵子学说及遗传密码破译。传密码破译。14第14页15第15页中心法则描述是遗传信息传递表示路径原理。中心法则描述是遗传信息传递表示路径原理。16第16页（2）基因工程研究理论依据）基因工程研究理论依据l基因能够重组交换基因能够重组交换l基因可切割基因可切割l基因可转移基因可转移l遗传密码是通用遗传密码是通用l多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系l基因可经过复制把遗传信息传递给下一代基因可经过复制把遗传信息传递给下一代17第17页（3）技术上三大创造）技术上三大创造l60年代末年代末70年代：年代：DNA分子体外切割与连接技术。分子体外切割与连接技术。l70年代：基因工程载体使用。年代：基因工程载体使用。l70年代：年代：DNA分子序列分析、琼脂糖凝胶电泳、杂分子序列分析、琼脂糖凝胶电泳、杂交技术等。交技术等。1973年年Cohen等体外构建细菌质粒成功标志着基因等体外构建细菌质粒成功标志着基因工程诞生，这年定为工程诞生，这年定为基因工程诞生元年基因工程诞生元年。18第18页2、基因工程概念、基因工程概念(Geneengineering)l指用指用酶学方法酶学方法将将异源基因异源基因与与载体载体DNA进行进行体外重组，体外重组，将形成重组将形成重组DNA导入导入宿体细胞宿体细胞，使异源基因在宿体，使异源基因在宿体细胞中复制表示，从而到达改造生物品种或性状，细胞中复制表示，从而到达改造生物品种或性状，大量生产出人类大量生产出人类所需生物品种和产物所需生物品种和产物，也称分子克，也称分子克隆或重组隆或重组DNA技术。技术。工具酶工具酶目或靶基因(源自供体)受受体体载载体体基因工程基本内容和关键技术最终目19第19页3、基因工程主要内容、基因工程主要内容l从生物有机体基因组中，分离出带有目标基因从生物有机体基因组中，分离出带有目标基因DNA片段。片段。l将带有目标基因外源将带有目标基因外源DNA片段连接到能够自我复制并含有选择记号载片段连接到能够自我复制并含有选择记号载体分子上，形成重组体分子上，形成重组DNA分子。分子。l将重组将重组DNA分子转移到适当受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增分子转移到适当受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。殖。l从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得了重组从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得了重组DNA分子受体细胞，并筛分子受体细胞，并筛选出已经得到扩增目标基因。选出已经得到扩增目标基因。l将目标基因克隆到表示载体上，导入寄主细胞，使之在新遗传背景下将目标基因克隆到表示载体上，导入寄主细胞，使之在新遗传背景下实现功效表示，产生出人类所需要物质。实现功效表示，产生出人类所需要物质。20第20页三、基因工程普通步骤三、基因工程普通步骤21第21页生物材料生物材料RNADNAmRNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库人工合成人工合成目基因克隆载体克隆载体重组重组DNA受体细胞受体细胞克隆子克隆子转基因生物转基因生物1 1、基因工程基本技术路线、基因工程基本技术路线22第22页剪切剪切拼接拼接导入导入表示表示2、基因操作、基因操作基本步骤基本步骤载载体体供体供体目基因受受体体工具酶工具酶23第23页即基因工程是基因一个操作平台与技术基因工程五大基本操作单元：切、接切、接、转、增转、增、检检 DNA体外重体外重组组转化子筛选转化子筛选与判定与判定某一段某一段DNA可在受体细胞可在受体细胞内进行复制，为制备大量内进行复制，为制备大量纯化纯化DNA片段提供可能片段提供可能可把来自任何生物基因可把来自任何生物基因转移到与其毫无关系任转移到与其毫无关系任何其它受体细胞中何其它受体细胞中重组重组DNA分子转分子转化与扩增化与扩增24第24页l工具酶 l目基因（制备）l基因载体 l基因受体 基因工程四大要素基因工程四大要素25第25页第二节第二节 工具酶工具酶基因工程技术中对核酸精雕细刻主要用基因工程技术中对核酸精雕细刻主要用酶酶作为工具作为工具26第26页一、限制性内切酶一、限制性内切酶（Restrictionendonuclease）1、概念、概念l指一类以环形或线形双链指一类以环形或线形双链DNA为为底物底物，能识别双链，能识别双链DNA中中特殊核苷酸序列特殊核苷酸序列，并在适当反应条件下使每条，并在适当反应条件下使每条链一定位点上链一定位点上磷酸二酯键磷酸二酯键断开，产生含有断开，产生含有3-OH和和5-P基团基团DNA片段片段内切脱氧核糖核酸酶。内切脱氧核糖核酸酶。27第27页lI型酶：在识别位点很远地方任意切割型酶：在识别位点很远地方任意切割DNA链，识别特异链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。性差，且需辅助因子，应用价值不大。lII型酶：型酶：在其识别位点之中或临近确实定位点特异地切开在其识别位点之中或临近确实定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需子或只需Mg2+，适合基因工程。，适合基因工程。lIII型酶：在识别位点之外切开型酶：在识别位点之外切开DNA链，而且要求识别位点链，而且要求识别位点是反向重复序列，无规律；极少能产生完全切割片段，因是反向重复序列，无规律；极少能产生完全切割片段，因而不具备实用价值，也没有些人将其商业化。而不具备实用价值，也没有些人将其商业化。2、限制性内切酶种类、限制性内切酶种类28第28页1973年由年由H.OSmith和和D.Nathans提议命名系统提议命名系统l由三部分组成，即由三部分组成，即菌系编号、菌株名、分离次序菌系编号、菌株名、分离次序。（1）用属名第一个字母（大写）和种名前两个字母（小写）组）用属名第一个字母（大写）和种名前两个字母（小写）组成成3个字母略语表示寄主菌物种名，斜体书写。个字母略语表示寄主菌物种名，斜体书写。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示；流感嗜血杆菌（流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。（2）菌株名以非斜体符号加在前三个字母后面。如Ecok,EcoR（3）同一菌株中有不一样限制性内切酶时，按分离次序用罗马字母表示，正体书写。如EcoRI，EcoRV。3、限制性内切酶命名标准、限制性内切酶命名标准29第29页比如：流感嗜血菌比如：流感嗜血菌d株株 属名属名 种名种名 株名株名Haemophilus influenzaedHind30第30页（1）作用机制）作用机制l限制性内切酶以环状或线性双链限制性内切酶以环状或线性双链DNA为为底物底物，在，在一定条件下，识别一定核苷酸序列，在两条链特一定条件下，识别一定核苷酸序列，在两条链特定定磷酸二酯键磷酸二酯键上催化切开，产生含有上催化切开，产生含有3-OH和和5-P基团基团DNA片段。片段。4、限制性内切酶作用机制和方式、限制性内切酶作用机制和方式31第31页（2）酶切特点）酶切特点l识别双链识别双链DNA分子中分子中48对碱基特定序列对碱基特定序列l大部分酶切割位点在识别序列大部分酶切割位点在识别序列内部或两侧内部或两侧l识别切割序列呈经典对称识别切割序列呈经典对称回文结构回文结构。EcoR切割位点切割位点 EcoR识别序列识别序列5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5切割位置识别结构识别长度32第32页l识别序列：识别序列：限制性核酸内切酶在双链限制性核酸内切酶在双链DNADNA上能够识别上能够识别特殊核苷酸序列特殊核苷酸序列。（同分子中识别序列短出现几率。（同分子中识别序列短出现几率大，反之亦然）大，反之亦然）l稀切酶：稀切酶：能够识别长序列及富集能够识别长序列及富集GCGC和和ATAT识别序列识别序列（几率小）内切酶。（几率小）内切酶。l同裂酶：同裂酶：识别相同序列限制酶识别相同序列限制酶l同尾酶：同尾酶：识别序列不一样，但切割得到识别序列不一样，但切割得到DNADNA片段含有片段含有相同黏性末端。相同黏性末端。各种类型见各种类型见P18-1933第33页黏性末端：黏性末端：被限制酶被限制酶交织切开交织切开DNA两条单链切两条单链切口，带有几个伸出核苷酸，它们之间碱基恰好口，带有几个伸出核苷酸，它们之间碱基恰好互补配对。（互补配对。（5粘性和粘性和3粘性）粘性）G A A T T CC T T A A GG C T T A AA A T T C G（3）切割方式）切割方式5-P3-OH3-OH5-P5-P5-P3-OH3-OHEcoR形成含有互补碱基形成含有互补碱基序列单链黏性末序列单链黏性末端端5-GAATTC-334第34页EcoR产生产生5粘性末端粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C55G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C537475G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5EcoR35第35页PstI产生产生3粘性末端粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C55G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C537475G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5PstI36第36页比如：比如：EcoRV识别位置是：识别位置是：5GAT|ATC33CTA|TAG5其切割后形成其切割后形成5GAT和和ATC3、3CTA和和TAG5。平整末端：平整末端：同一位点同一位点平齐切割平齐切割DNA两条两条链而形成双链末端。链而形成双链末端。37第37页l反应底物反应底物（DNA）l内切酶用量内切酶用量（活力决定）（活力决定）l反应缓冲液反应缓冲液（最适（最适pH7.5）l适当温度（适当温度（37）5、限制性内切核酸酶反应系统、限制性内切核酸酶反应系统38第38页反应系统缓冲液反应系统缓冲液lTris-HCl50mMpH7.5lMgCl210mM低盐酶：低盐酶：050mMlNaCl0150mM中盐酶：中盐酶：100mMlDTT/BSA1mM高盐酶：高盐酶：150mMlVolume20100LlT,T37，11.5hl1U核酸内切酶活性：核酸内切酶活性：在最正确反应条件下反应在最正确反应条件下反应1小时，完全水解小时，完全水解1g标准准DNA所需所需酶量。量。39第39页l琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在碱性环境中带负电荷，在分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动，外加电场作用下向正极泳动，不一样不一样DNA，分子量大，分子量大小及构型不一样，电泳时泳动率就不一样，从而分出不小及构型不一样，电泳时泳动率就不一样，从而分出不一样区带。电泳驱动力靠一样区带。电泳驱动力靠DNA骨架本身负电荷骨架本身负电荷。l聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理同，均为分子筛效应。l使用特点：使用特点：琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。普通琼脂糖凝胶适合用于分离大小在0.2-50Kb范围内DNA片段。判定判定凝胶电泳凝胶电泳40第40页41第41页42第42页43第43页观察观察:凝胶成像系统凝胶成像系统44第44页pBI121双酶切大片段取得 BigfragmentobtainedfrompBI121afterdoubleenzymedigestionpMD18-T curcin双酶切小片段取得 SmallfragmentobtainedfrompMD18-Tcurcinafterdoubleenzymedigestion13 kb13 kb 酶切片段酶切片段45第45页二、二、DNA连接酶连接酶1 1、概念：、概念：能催化能催化DNA分子中相邻分子中相邻3-OH和和5-P末末端之间形成端之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键，即可封闭双链，即可封闭双链DNA上相邻上相邻核苷酸之间单链缺口。核苷酸之间单链缺口。46第46页2、主要两种、主要两种DNA连接酶连接酶 （1）大肠杆菌大肠杆菌-DNA连接酶：连接酶：只能连接黏性末端，需NAD+为辅助因子。（同一个限制酶或两种同尾酶）（2）T4-DNA连接酶：连接酶：连接黏性末端、平整末端，需ATP为辅助因子。（同一个或两种限制酶）作用：作用：DNA重组中促使载体与目标DNA连接（即两种起源DNA）。（最适温度37，或415）47第47页5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C537EcoR5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5P-A-A-T-T-C-X-Y-G-OHOH-G-Y-X-C-T-T-A-A-P大肠杆菌大肠杆菌连接酶连接酶-X-Y-Y-X-48第48页载载体体供体供体目基因受受体体工具酶工具酶49第49页（1）DNA片段末端修饰片段末端修饰l核酸外切酶：切成平整末端核酸外切酶：切成平整末端l末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端l碱性磷酸酶：将碱性磷酸酶：将5-P修饰成修饰成5-OH，预防载体自我环化，预防载体自我环化（2）DNA片段加连杆后连接片段加连杆后连接l人工合成连杆或衔接头人工合成连杆或衔接头3、非互补黏性末端、非平整末端连接、非互补黏性末端、非平整末端连接50第50页三、其它工具酶三、其它工具酶lDNA聚合酶：聚合酶：PCR扩增扩增lT4多聚核苷酸激酶：催化多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸转移至上磷酸转移至5-OH上，作为上，作为DNA5-末端标识。末端标识。lS1核酸酶：分析核酸酶：分析DNA-RNA杂合子结构；杂合子结构；l反向转录酶：以反向转录酶：以RNA为模板，反向转录形成与为模板，反向转录形成与已知已知RNA互补互补DNA链（构建链（构建cDNA文库）。文库）。51第51页第三节第三节 目标基因制备目标基因制备一、生物学方法一、生物学方法二、化学合成法二、化学合成法三、基因文库法三、基因文库法四、四、PCR扩增法扩增法52第52页1、目标基因定义、目标基因定义 l目标基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和目标基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表示特定基因或表示特定基因或DNADNA片段，能编码某一产物或片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。某一性状，又称特异基因或靶基因。2、目标基因起源、目标基因起源l 真核生物染色体基因组（人和动物）；真核生物染色体基因组（人和动物）；原核生原核生 物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。53第53页一、生物学方法一、生物学方法l工作原理：工作原理：把染色体把染色体DNA用用限制内切酶限制内切酶切切割，将全部片段链接到割，将全部片段链接到某载体某载体上，转入上，转入大大肠杆菌中增殖肠杆菌中增殖。再用适当方法筛选出含目。再用适当方法筛选出含目标基因标基因重组体菌落重组体菌落，从重组体菌落提取，从重组体菌落提取DNA，经酶切后取得目标基因。，经酶切后取得目标基因。54第54页ori目基因EcoRIBamHIPstI对象：对象：原核生物基因组较小，基因轻易定原核生物基因组较小，基因轻易定位位，或已知核苷酸序列，或已知核苷酸序列DNA分子。分子。优点：优点：快速简便、产物纯度高。快速简便、产物纯度高。55第55页二、二、化学合成法化学合成法假如已知某基因核苷酸序列，或依据某种基因产物氨基酸序列推导出该多肽编码基因核苷酸序列，能够利用DNA合成仪经过化学合成原理合成目标基因。通常是先合成一定长度（200bp）、含有特定序列寡核苷酸片段。然后将寡核苷酸适当连接组装成完整目标基因56第56页合成引物合成引物合成合成DNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆合成基因片断合成基因片断DNA片断连接重组，采取片断连接重组，采取DNA片段连接酶片段连接酶有有E.coli DNA、T4-DNA连接酶连接酶步步 骤：骤：57第57页l工作原理：工作原理：把某种生物把某种生物基因组全部遗传信息基因组全部遗传信息经经过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体之中，过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物基因组文库。这个群体即为这种生物基因组文库。l包含某种生物基因组全部基因受体菌群体称为包含某种生物基因组全部基因受体菌群体称为该生物基因组文库该生物基因组文库。三、基因文库法三、基因文库法58第58页抽提基因组抽提基因组DNA制备制备DNA片段片段DNA片段与载体重组片段与载体重组转化宿主菌体转化宿主菌体筛选目基因（核酸探针法、免疫结合法）基因文库构建流程图基因文库构建流程图物理方法物理方法(剪切或超声波剪切或超声波)或或限制性内切酶限制性内切酶噬菌体、噬菌体、plasmid、YAC等等每个细菌内都携带一个每个细菌内都携带一个重组重组DNA分子多个拷分子多个拷贝。全部细菌所携带贝。全部细菌所携带各种染色体各种染色体DNA片段就片段就涵盖了基因组全部信涵盖了基因组全部信息，即基因文库。息，即基因文库。59第59页构建构建基因基因library+ligase60第60页Aplasmidlibrary61第61页四、四、PCR扩增法（聚合酶链式反应）扩增法（聚合酶链式反应）PolymerasechainreactionlPCR技术是基因扩增技术一次重大革新；技术是基因扩增技术一次重大革新；l1985年美国年美国PE-Cetus企业企业Millis等研制，于等研制，于1993年获诺年获诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。lPCR技术是指模拟技术是指模拟DNA聚合酶在生物体内催化作用，聚合酶在生物体内催化作用，在体外进行特异在体外进行特异DNA序列合成及扩增技术。序列合成及扩增技术。l前提条件是必须对目标基因有一定了解，需要设计引前提条件是必须对目标基因有一定了解，需要设计引物。物。62第62页PCR技术基本原理类似于技术基本原理类似于DNA天然复制天然复制过程，过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。引物。解旋酶双链变单链DNA聚合酶使链延伸引物DNA天然复制天然复制63第63页1、PCR原理原理lPCR技术实质为体内技术实质为体内DNA复制体外模拟。复制体外模拟。l即即使双链使双链DNA热变性热变性而分开成为单链而分开成为单链DNA，退火退火后在后在低温下，两个与低温下，两个与模板模板互补互补引物引物与单链与单链DNA配对结合，配对结合，再在中温下利用再在中温下利用TaqDNA聚合酶聚合酶聚合活性和热稳定性聚合活性和热稳定性进行进行聚合（延伸）反应聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火和延。每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增特定伸为一个循环，所扩增特定DNA序列数量按几何指数序列数量按几何指数增加。增加。64第64页PCR技术原理技术原理模板与引物复性,引物是与模板某区序列互补一小段DNA片段。55C在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋氢键断裂，形成单链DNA94C从结合在特定DNA模板上引物为出发点，按53方向沿着模板次序合成新DNA链72C变性变性退火退火延伸延伸65第65页PCR技术技术原理原理示意图示意图靶序列靶序列变性和引变性和引物复性物复性循环循环1循环循环2循环循环3变性和引变性和引物复性物复性链延伸链延伸Tag聚合酶聚合酶链延伸链延伸66第66页PCR基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增67第67页20-35cycles7257min412h或更长时间或更长时间7224min94-960.51min929646min60370.5-1min变性使双链变性使双链变为单链变为单链退火使复性退火使复性-引物引物与模板与模板DNA结合结合Tac聚合酶使聚合酶使延伸延伸2、PCR反应过程反应过程68第68页模板模板DNA变性：变性：模板模板DNA加热至加热至9495一定时一定时间后，使模板间后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成双链扩增形成双链DNA解离成为单链，方便它与引物结合，为下轮反解离成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备；应作准备；模板模板DNA与引物退火与引物退火(复性复性)：模板模板DNA经加热经加热变性成单链后，温度降至变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；单链互补序列配对结合；2、PCR反应步骤反应步骤69第69页引物延伸：引物延伸：DNA模板模板引物结合物在引物结合物在TaqDNA聚聚合酶作用下，以合酶作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA链互补半保留复制链。链互补半保留复制链。重复循环重复循环“变性变性-退火退火-延伸延伸”过程，就可取得过程，就可取得更多更多“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可成为下，而且这种新链又可成为下次循环模板。每完成一个循环需次循环模板。每完成一个循环需24分钟，分钟，23小小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。70第70页PCR扩增仪扩增仪71第71页3、PCR反应体系反应体系l反应缓冲液反应缓冲液 18（l）ldNTP（原料基质，由（原料基质，由四种三磷酸脱氧核苷酸四种三磷酸脱氧核苷酸l即即dATP、dGTP、dTTP、dCTP组成）组成）2lPrimer1（引物）（引物）0.5lPrimer2（引物）（引物）0.5lDNA分子（模板）分子（模板）1lMg2+（酶辅助因子，（酶辅助因子，10buffer）2.5lTaq酶（酶（DNA聚合酶）聚合酶）0.572第72页4、PCR特点特点l灵敏度高灵敏度高PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。l特异性强特异性强引物序列及其与模板结合特异性是决定引物序列及其与模板结合特异性是决定PCR反反应结果关键；引物设计基本标准是最大程度地提升扩增效率应结果关键；引物设计基本标准是最大程度地提升扩增效率和特异性，同时尽可能降低非特异性扩增。和特异性，同时尽可能降低非特异性扩增。l简便、快速、重复性好简便、快速、重复性好一次性加好反应液，24小时完成扩增。l对标本纯度要求低对标本纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织粗提DNA。73第73页第四节第四节 基因克隆载体基因克隆载体 一、质粒一、质粒二、二、噬菌体噬菌体 三、其它三、其它74第74页基因载体概念基因载体概念l将外源将外源DNA或目标基因带入适当宿主或目标基因带入适当宿主细胞（细胞（hostcell）工具或运载体。）工具或运载体。75第75页l本身是一个复制子，能自我复制；本身是一个复制子，能自我复制；l相对分子质量较小相对分子质量较小，限制性内切酶切点少，宜于接，限制性内切酶切点少，宜于接收目标基因；收目标基因；l能给宿主细胞（受体）提供可能给宿主细胞（受体）提供可选择标识选择标识，有可供识别表形特征，便于筛选；有可供识别表形特征，便于筛选；l只有单一限制性内切酶切点只有单一限制性内切酶切点，即经某限制性内切酶，即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源闭环打开接纳外源DNA片片段，又不会丢失自己片段。段，又不会丢失自己片段。以指示载体或重以指示载体或重组组DNA分子是否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞利于载体制备利于载体制备载体应具备条件：载体应具备条件：提升外源基提升外源基因装载量因装载量76第76页一、质粒一、质粒l质粒（质粒（plasmid）是寓于宿主细胞中染色体外遗传是寓于宿主细胞中染色体外遗传因子，是因子，是双螺旋闭环双螺旋闭环DNA分子分子。独立于染色体之独立于染色体之外进行复制和遗传，又依赖于宿主编码酶和蛋白外进行复制和遗传，又依赖于宿主编码酶和蛋白质来进行复制和转录，质来进行复制和转录，相对分子量相对分子量100010000ku。l广泛存在于细菌、放线菌及酵母细胞质中，一些广泛存在于细菌、放线菌及酵母细胞质中，一些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。77第77页染色体和质粒区分与联络染色体和质粒区分与联络l染色体与质粒均与生物遗传相关。染色体与质粒均与生物遗传相关。二者都带有能转录并能表示为蛋白质基因，染色体是二者都带有能转录并能表示为蛋白质基因，染色体是生物信息携带者，其带有大量遗传信息，而质粒则是生物信息携带者，其带有大量遗传信息，而质粒则是携带一些表示有特殊功效蛋白质基因，有些是对生物携带一些表示有特殊功效蛋白质基因，有些是对生物绝对需要。绝对需要。l染色体与质粒化学本质不一样：染色体与质粒化学本质不一样：染色体化学本质是染色体化学本质是由蛋白质和由蛋白质和DNA组成，质粒是组成，质粒是DNA，只有质粒能够作，只有质粒能够作为运载体，染色体不能够。为运载体，染色体不能够。78第78页质粒载体普通特征质粒载体普通特征染色体染色体DNADNA质粒质粒DNA大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞79第79页1、质粒类型、质粒类型l严紧型质粒：严紧型质粒：处于处于“严紧控制严紧控制”之下，之下，即即其其复制是同宿主细胞复制偶联同时。所以在每个细复制是同宿主细胞复制偶联同时。所以在每个细胞中质粒胞中质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为这称为“严紧型严紧型”质粒。质粒。80第80页l松弛型质粒：松弛型质粒：处于处于“松弛控制松弛控制”之下，每个细菌中之下，每个细菌中能够有能够有10200份拷贝份拷贝。更主要是松弛型质粒拷贝数。更主要是松弛型质粒拷贝数可因宿主细胞停顿合成蛋白质而增加至几千份，如可因宿主细胞停顿合成蛋白质而增加至几千份，如pBR322。l宿主细胞不合成蛋白质时，宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒复染色体和严紧型质粒复制都中止，但松弛型质粒仍继续进行复制。所以在制都中止，但松弛型质粒仍继续进行复制。所以在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素氯霉素处理处理（在培养液中加入适量氯霉素）抑制蛋白质合成。（在培养液中加入适量氯霉素）抑制蛋白质合成。81第81页2、质粒、质粒DNA提取提取l选择性抽提法：选择性抽提法：在较温和条件下，用溶菌酶溶菌，形成细胞在较温和条件下，用溶菌酶溶菌，形成细胞碎片因染色体碎片因染色体DNA和质粒和质粒DNA有相对分子量上差异，用高速离有相对分子量上差异，用高速离心方法分离。相对分子量较小质粒心方法分离。相对分子量较小质粒DNA留于上清液，经乙醇沉留于上清液，经乙醇沉淀得到质粒淀得到质粒DNA粗制品。粗制品。l碱性碱性SDS法：法：在在pH12.012.5范围内使染色体中双螺旋开链范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链选择性变性，而闭环双链DNA不变性。经乙酸钠中和后，不变性。经乙酸钠中和后，SDS引发蛋白质引发蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高复合物和相对分子质量高DNA沉淀，再经沉淀，再经高速离心将质粒高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。留于上清液中而分离。82第82页碱性碱性SDS法提取质粒法提取质粒DNA步骤步骤搜集细胞搜集细胞加入加入溶液溶液I(50mM葡萄糖葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,45mg/mL溶菌酶）溶菌酶）加入加入溶液溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入加入溶液溶液III(3MNaAcpH4.8)离心除去沉淀，得含质粒离心除去沉淀，得含质粒DNA上清液上清液苯酚抽提去除蛋白质苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀搜集质粒乙醇沉淀搜集质粒DNA在强碱性环境在强碱性环境中暴露时间过中暴露时间过长，长，cDNA可发可发生不可逆变性生不可逆变性83第83页3、质粒、质粒DNA纯化纯化l碱性蔗糖密度梯度离心法：碱性蔗糖密度梯度离心法：染色体双螺旋开链染色体双螺旋开链DNA易变易变性，而闭环双链质粒性，而闭环双链质粒DNA不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒DNA沉降速度大于变性沉降速度大于变性DNA而分离纯化。而分离纯化。l氯化铯氯化铯-溴化乙锭（溴化乙锭（Et-Br）密度梯度离心法：）密度梯度离心法：染色体染色体双螺旋开链双螺旋开链DNA易和染料易和染料Et-Br结合而密度降低，质粒结合而密度降低，质粒DNA因为紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。因为紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。l硝酸纤维素膜吸附法：硝酸纤维素膜吸附法：硝酸纤维素膜吸附单链硝酸纤维素膜吸附单链DNA，染，染色体色体DNA易变性形成单链，而与质粒易变性形成单链，而与质粒DNA分离。分离。84第84页l删除非必需区：删除非必需区：减小质粒分子量，提升外源减小质粒分子量，提升外源DNA装载量（普通来说，大于装载量（普通来说，大于20kb质粒极难导质粒极难导入受体细胞）。入受体细胞）。l加入新遗传标识基因：加入新遗传标识基因：l引入含有各种限制酶识别及切割位点引入含有各种限制酶识别及切割位点DNA序列：序列：即多克隆位点即多克隆位点(multiplecloningsites，MCS)。4、质粒改造构建、质粒改造构建85第85页惯用质粒载体：惯用质粒载体：（1）大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒载载体体AmprTet r识别位点识别位点pBR322（4363bp）pBR322（含两个抗生素抗性基因）（含两个抗生素抗性基因）抗氨苄青霉素抗氨苄青霉素抗四环素抗四环素复制起始点复制起始点86第86页pUC18/19半乳糖苷酶肽基因半乳糖苷酶肽基因菌落蓝菌落蓝/白选择标识白选择标识加入加入87第87页lacZ蓝蓝-白斑筛选白斑筛选：l含有完整含有完整乳糖操纵子菌体能乳糖操纵子菌体能翻译翻译LacZ基因编码基因编码半乳糖苷半乳糖苷酶酶，该酶能水解生色底物，该酶能水解生色底物X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源株变蓝。当外源DNA插入后，插入后，LacZ基因不能表示，菌株呈基因不能表示，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝称之为蓝-白斑筛选。白斑筛选。88第88页（2）穿梭质粒载体（）穿梭质粒载体（shuttlevector）l指指能在两种不一样生物中复制质粒载体能在两种不一样生物中复制质粒载体。如有质。如有质粒载体除了含大肠杆菌源质粒粒载体除了含大肠杆菌源质粒ori外，还含有蓝藻源外，还含有蓝藻源质粒质粒ori，是这两种生物穿梭质粒载体；还有能在原是这两种生物穿梭质粒载体；还有能在原核生物（如核生物（如E.coli）、）、真核细胞（如酵母）中复制。真核细胞（如酵母）中复制。l含有不止一个含有不止一个ori、能携带插入序列在不一样种类能携带插入序列在不一样种类宿主细胞中繁殖载体称为穿梭载体（宿主细胞中繁殖载体称为穿梭载体（shuttlevectors）。）。89第89页二、噬菌体l噬菌体（噬菌体（phage）是病毒一个，没有细胞结构，由核）是病毒一个，没有细胞结构，由核酸和蛋白质组成。因其缺乏代谢酶体系，酸和蛋白质组成。因其缺乏代谢酶体系，不能脱离不能脱离宿主细胞而自行繁殖，只能在活体细胞中生长并对宿主细胞而自行繁殖，只能在活体细胞中生长并对宿主细胞有严格专一性宿主细胞有严格专一性。可作为基因载体主要是。可作为基因载体主要是噬噬菌体。菌体。l研究始于上世纪研究始于上世纪50年代，年代，1974年年Davis发觉发觉噬菌体噬菌体失去失去20%DNA仍不失活，认为此缺失部分可装载其仍不失活，认为此缺失部分可装载其它它DNA，至今已构建，至今已构建100各种。各种。90第90页噬菌体主要类型：噬菌体主要类型：l插入