酶联免疫吸附实验.ppt
酶联免疫吸附实验(ELISA)山东省医学科学院基础所免疫室1第一部分第一部分:基本实验原理基本实验原理基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗原或抗体的定性或定量检测。2第二部分:常用实验方法一、间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测定（图1）。3图1:间接法测抗体示意图固相抗原待测标本(含相应抗体)酶标抗抗体4第二部分:常用实验方法二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和底物显色进行测定（图2）。5 图2:双抗体夹心法测抗原示意图6第二部分:常用实验方法三、竞争法 此法常用于测抗原和半抗原，也用于测抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原，使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。7图3:竞争法测抗原示意图8第三部分第三部分:方法的特点和进展方法的特点和进展 ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、灵敏、特异，操作简便、快速，实验设备要求较为简单，应用范围快速，实验设备要求较为简单，应用范围广泛，无放射性污染广泛，无放射性污染等优点，成为目前普及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中应用的常见技术（BAS-ELISA），其中ABC-ELISA法更为常用，其基本原理为，固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素-酶标生物素复合物+底物显色。9第四第四.一部分一部分:人人TNF-检测实验原理检测实验原理基本实验原理:双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-会与单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素化的抗人TNF-抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-抗体与结合在单抗上的人TNF-结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有人TNF-，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A值，人TNF-浓度与A450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人TNF-浓度。10第四.二部分:实验试剂、材料和仪器设备实验标本试剂盒及其内容物实验材料仪器设备11实验标本人外周血(血清)1.收集血液的试管应为无热源和内毒素试管2.血浆抗凝剂为EDTA3.标本应清澈透明,如有悬浮物应离心除去4.避免溶血,高血脂5.标本收集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于-20,避免反复冻融6.可根据实际情况,将标本作适当倍数稀释(建议做预实验,以确定稀释倍数)12试剂盒及其内容物1a 标准品1支(4000pg，冻干)4 1b 标准品和标本稀释液(粉红色)1瓶(15ml)4 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60l)4 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60l)4(避光)3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4 4 浓缩洗涤液 20(兰色)1瓶(15ml)4 5 显色剂1瓶(6ml)4 6 终止液1瓶(12ml)4 抗体包被板条812 或 86 4 封板胶纸1张 说明书1份 *:96/48 Test13实验材料与设备实验材料与设备1.加样器:0.5-10ul,2-20ul,20-200ul,200-1000ul2.吸头:10ul,200ul,1000ul3.酶标仪:450nm4.双蒸水或去离子水,坐标纸等14第四.三部分:实验方法与步骤1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4。3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻干标准品(1a),静置15分钟后混匀，按说明稀释至所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完的复溶标准品放入-20保存,稀释的标准品不应重复使用。4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可做预实验，以确定稀释倍数)。15第四.三部分:实验方法和步骤5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回46、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37孵育90分钟。7、洗板4次。8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)工作液 100ul/孔，封住板孔，37孵育60分钟。16第四.三部分:实验方法和步骤9、洗板4次。10、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合工作液(100 ul/孔).封住板孔,37孵育30分钟.11、洗板4次.12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37孵育10-20分钟。13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测A450值(5分钟内)。17标 准 品 稀 释 方 法2000pg/ml1000pg/ml500pg/ml250pg/ml125pg/ml62.5pg/ml31.25pg/ml500lstd.500l500l500l500l500l18第四.四部分:结果判断与计算1、每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。1920第四第四.五部分五部分:注意事项注意事项(1)1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350l，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗4次。2、冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，加热溶解后再配制。3、装量极少的试剂(2a和3a)应先离心或用手甩几下，以使管壁液体沉于管底。4、不同批号的试剂盒组份不能混用。21第四第四.五部分五部分:注意事项注意事项(2)5、检测标本如为组织培养液，应用培养液作为标准品/样品稀释液。22
