年高考生物总复习重点精品土壤中分解尿素的细菌的分离与计数人教版选修省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

课题课题2 2土壤中分解尿素细菌分离土壤中分解尿素细菌分离与计数与计数专题专题2 2微生物培养与应用微生物培养与应用第1页一、课题背景一、课题背景1 1、尿素利用、尿素利用尿素尿素是一个主要是一个主要农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作被农作物物吸收。吸收。土壤中细菌将尿素土壤中细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被之后才能被植物利用。植物利用。2 2、细菌利用尿素原因、细菌利用尿素原因土壤中细菌分解尿素是因为它们土壤中细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+H+H2 2OO+CO+CO2 2NHNH3 3第2页3 3、常见分解尿素微生物、常见分解尿素微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，一些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，一些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4、课题目从土壤中分离出能够分解尿素细菌从土壤中分离出能够分解尿素细菌统计每克土壤样品中终究含有多少这么细菌统计每克土壤样品中终究含有多少这么细菌一一.研究思绪研究思绪.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照第3页 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目标菌种时要依据它对生存环境要寻找目标菌种时要依据它对生存环境要求，到对应环境中去寻找。求，到对应环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大多数微生物只有多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一个在体外将一个在体外将少许少许DNADNA大量复制大量复制技术，此项技技术，此项技术要求使用术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）DNADNA聚合酶。聚合酶。第4页要分离一个微生物，必须依据该微生物特点，要分离一个微生物，必须依据该微生物特点，包包含营养、生理、生长条件等；含营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长环境，造成有利于该菌生长环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再经过培养一定时间后，该菌数量上升，再经过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、试验室中微生物筛选原理：、试验室中微生物筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目标菌株目标菌株生长条件生长条件(包含营养、包含营养、温度、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其它微生物生，同时抑制或阻止其它微生物生长。长。第5页15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素细菌分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素细菌分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基第6页在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基培养基氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶微生物才能微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶微生物因脲酶微生物因为不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，为不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素微生物。尿素微生物。5 5、培养基选择分解尿素微生物原理、培养基选择分解尿素微生物原理第7页1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物数量。样品中微生物数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌计数；不适于对运动细菌计数；需要相对高细菌浓度；需要相对高细菌浓度；个体小细菌在显微镜下难以观察；个体小细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点第8页2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成一个菌落是由一个单细胞繁殖而养基上所形成一个菌落是由一个单细胞繁殖而成，即一个菌落代表原先一个单细胞。成，即一个菌落代表原先一个单细胞。惯用方法：稀释涂布平板法。惯用方法：稀释涂布平板法。每克样品中菌落数每克样品中菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长平均代表某一稀释度下平板上生长平均菌落数，菌落数，V V代表涂布平板时所用稀释液体积代表涂布平板时所用稀释液体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。第9页注意事项注意事项为了确保结果准确，普通选择菌落数在为了确保结果准确，普通选择菌落数在3030300300平板上进行计数。平板上进行计数。为使结果靠近真实值可将为使结果靠近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上平皿中个或三个以上平皿中，经涂布，培养计算出菌，经涂布，培养计算出菌落平均数。落平均数。统计菌落往往比活菌实际数目低。统计菌落往往比活菌实际数目低。涂布平板法所选择稀释度很主要，普通以三涂布平板法所选择稀释度很主要，普通以三个稀释度中第二个稀释度所出现平均菌落数在个稀释度中第二个稀释度所出现平均菌落数在5050个左右为最好。个左右为最好。第10页计数法计数法直接计数法、直接计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比浊法、膜过滤法膜过滤法第11页例题：统计菌落数目方法有 （）A.B.A.B.C.D.C.D.DD涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接计数法直接计数法 比浊法比浊法 生理指标法生理指标法 膜过滤法膜过滤法第12页设置对照主要目标设置对照主要目标是排除试验组中非测试原因对是排除试验组中非测试原因对试验结果影响，提升试验结果可信度。试验结果影响，提升试验结果可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素细菌筛选与统计菌落数目标实例：在做分解尿素细菌筛选与统计菌落数目标试验时，试验时，A A同学从对应同学从对应10106 6倍稀释培养基中筛选出倍稀释培养基中筛选出大约大约150150个菌落，不过其它同学在一样稀释度下个菌落，不过其它同学在一样稀释度下只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原原因因：土土样样不不一一样样，培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或者是混入了其它含氮物质或者是混入了其它含氮物质)第13页小结：经过这个事例能够看出，试验结果要有小结：经过这个事例能够看出，试验结果要有说服力，对照设置是必不可少。说服力，对照设置是必不可少。方案一：方案一：由其它同学用与由其它同学用与A同学相同土样进行试验同学相同土样进行试验 方案二：方案二：将将A同学配制培养基在不加土样情况下同学配制培养基在不加土样情况下进行培养，作为空白对照，以证实培养基是否受进行培养，作为空白对照，以证实培养基是否受到污染。到污染。结果预测：结果预测：假如结果与假如结果与A同学一致，则证实同学一致，则证实A无误；无误；假如结果不一样，则证实假如结果不一样，则证实A同学存在操作失误或培同学存在操作失误或培养基配制有问题。养基配制有问题。第14页二二.试验详细操作试验详细操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好信封左右，再取样，将样品装入事先准备好信封中。中。取土样用小铁铲和盛土样信封在使用前都要取土样用小铁铲和盛土样信封在使用前都要灭菌。灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源制备以尿素为唯一氮源选择培养基选择培养基。第15页应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不一样微生物采取不一样稀释度原因：不一样微生物在土壤中含量不一样目标：确保获得菌落数在30300之间、适于计数平板 三三 样样 品品稀释稀释第16页为为何何分分离离不不一一样样微微生生物物要要采采取取不不一一样样稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素细细菌菌数量，选取稀释范围相同吗？数量，选取稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不一一样样。比比如如在在干干旱旱土土壤壤中中上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌菌数数约约为为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为取取得得不不一一样样类类型型微微生生物物，就就需需要要按按不不一一样样稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应该该有有针针对对性性地地提提供选择培养条件。供选择培养条件。第17页.取样涂布取样涂布试验时要试验时要对培养皿作对培养皿作好标识。注好标识。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。假如得到了假如得到了假如得到了假如得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300平板，平板，平板，平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落计数，假如同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准同一稀释倍数三个重复菌落数相差较大，表明试验不准确确确确，需要重新试验。，需要重新试验。，需要重新试验。，需要重新试验。第18页.微生物培养与观察微生物培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时统计作为结果，选取菌落数目稳定时统计作为结果，以预防因以预防因培养时间不足而造成遗漏菌落数目。培养时间不足而造成遗漏菌落数目。培养不一样微生物往往需要不一样培养温度。培养不一样微生物往往需要不一样培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828温度下培养温度下培养3 34d4d。第19页微微生生物物培培养养与与观察观察第20页三.结果分析与评价1.经过对照试验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素微生物。2.提醒：选择每个平板上长有30300个菌落稀释倍计算每克样品菌数最适当。同一稀释倍数三个重复菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。第21页四、操作提醒四、操作提醒 无菌操作无菌操作 做好标识做好标识 规划时间规划时间 第22页五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源培养基中加入酚在以尿素为唯一氮源培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，假如红指示剂。培养某种细菌后，假如PHPH升升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量方法是将一定体积水用细测定饮水中大肠杆菌数量方法是将一定体积水用细测定饮水中大肠杆菌数量方法是将一定体积水用细测定饮水中大肠杆菌数量方法是将一定体积水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到菌过滤器过滤后，将滤膜放到菌过滤器过滤后，将滤膜放到菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养基上培养基上培养基上培养，大肠杆菌培养，大肠杆菌培养，大肠杆菌培养，大肠杆菌菌落展现黑色菌落展现黑色菌落展现黑色菌落展现黑色，经过记述得出水样，经过记述得出水样，经过记述得出水样，经过记述得出水样中大肠杆菌数量。中大肠杆菌数量。中大肠杆菌数量。中大肠杆菌数量。第23页大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上经典特征上经典特征 第24页本课题知识小结本课题知识小结:第25页六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定正确表述是对细菌群体生长规律测定正确表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B最少接种一个细菌最少接种一个细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗营养物质及时补充消耗营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律测定生长规律测定是人们在一定条件下进行。这是人们在一定条件下进行。这些条件是：一些条件是：一种细菌、恒定容积培养基，液体培养基、定时测定种细菌、恒定容积培养基，液体培养基、定时测定细菌总数细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌生长规律。测定时只。在这些条件下，才能测定出细菌生长规律。测定时只能用一个细菌子细胞群体改变规律表示微生物生长；恒定容积是能用一个细菌子细胞群体改变规律表示微生物生长；恒定容积是给微生物提供一定生存环境；液体培养基才能经过样品推测细菌给微生物提供一定生存环境；液体培养基才能经过样品推测细菌总数。若接种各种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一个微生总数。若接种各种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一个微生物生长规律。在接种时，要确保一定接种量。物生长规律。在接种时，要确保一定接种量。答案：答案：A A第26页例例2 2在微生物群体生长规律测定中，种内斗在微生物群体生长规律测定中，种内斗争最显著最激烈时期是争最显著最激烈时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定时稳定时 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一个生态原因。种内斗争反应了种内生物解析：种内斗争是一个生态原因。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源争夺。在生活空间充裕，营养充分时候，对生存空间和生活资源争夺。在生活空间充裕，营养充分时候，种内斗争程度是比较低。伴随微生物个体数目标增加，每个个体种内斗争程度是比较低。伴随微生物个体数目标增加，每个个体生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，和资源争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在在稳定时稳定时种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物数目已经开始降低，种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物数目已经开始降低，pHpH已经极度不适于微生物生存，次级代谢产物积累到很高程度，已经极度不适于微生物生存，次级代谢产物积累到很高程度，这时微生物生存斗争主要是与无机环境斗争。这时微生物生存斗争主要是与无机环境斗争。答案：答案：C C第27页1.1.对细菌群体生长规律测定正确表述是（对细菌群体生长规律测定正确表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.最少接种一个细菌最少接种一个细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗营养物质及时补充消耗营养物质 2.2.使用选择培养基目标是（使用选择培养基目标是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要微生物大量繁殖使需要微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物特定性状与其它微生物加以区分表现某微生物特定性状与其它微生物加以区分3.3.能合成脲酶微生物所需要碳源和氮源分别是能合成脲酶微生物所需要碳源和氮源分别是()()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D第28页4.4.以下说法不正确是（以下说法不正确是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温度热泉中分离到耐高温TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶 B.B.统计某一稀释度统计某一稀释度5 5个平板菌落数依次为个平板菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数预计值作为该样品菌落数预计值 C.C.设置对照试验主要目标是排除试验组中非测试原因设置对照试验主要目标是排除试验组中非测试原因对试验结果影响，提升试验结果可信度对试验结果影响，提升试验结果可信度 D.D.同其它生物环境相比，土壤中微生物数量最大，种同其它生物环境相比，土壤中微生物数量最大，种类最多。类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多氮源物质较多氮源物质 B.B.较多碳源物质较多碳源物质 C.C.青霉素类药品青霉素类药品 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C第29页例3（江苏）抗生素作为治疗细菌感染药品，其高效性和巨大经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素发觉和应用含有划时代意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌 代谢产物。在生产和科研中，常选取处于 期青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时青霉菌代谢旺盛，和 比较稳定。对青霉菌菌体生长情况测定：取一定体积发酵液，经离心分离、重复洗涤后，再计算发酵罐中菌体总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体形态个体形态生理特征生理特征称菌体湿重称菌体湿重（称烘干后重量）（称烘干后重量）第30页第31页