《SDSPAGE电泳测定》课件.pptx

SDSPAGE电泳测定 制作人：制作者ppt时间：2024年X月目录第第1 1章章 SDSPAGE SDSPAGE电泳测定介绍电泳测定介绍第第2 2章章 样品制备样品制备第第3 3章章 SDS-PAGE SDS-PAGE胶的制备胶的制备第第4 4章章 SDS-PAGE SDS-PAGE电泳操作电泳操作第第5 5章章 显色和成像显色和成像第第6 6章章 总结和展望总结和展望 0101第1章 SDSPAGE电泳测定介绍 什么是SDSPAGE电泳测定离子半径和电荷密度原理简介蛋白检测、分离分析应用领域一代一代的改进发展历史 实验原理酰胺解离、还原、碱解等方式样品制备正、负极电泳缓冲液配制准备电泳胶电压、时间、电泳胶浓度等电泳条件选择 实验流程处理样品的体积、质量等样品加载电泳胶浸泡、定位等电泳操作染色剂的选择、操作时间等显色方式 电泳胶的成分不同SDSPAGE和常规PAGE的区别0103 02IEF、2D等蛋白电泳测定中的其他方法比较SDSPAGE优缺点分析灵敏、分辨能力强优点大分子量蛋白无法检测限制基于电泳的新技术的研究未来发展 如何判断如何判断SDSPAGESDSPAGE电泳电泳胶的浓度胶的浓度SDSPAGESDSPAGE电泳胶的浓度是影响分辨率的重要因素。通常电泳胶的浓度是影响分辨率的重要因素。通常会选用一定比例的丙烯酰胺、交联剂和电泳缓冲液进行配会选用一定比例的丙烯酰胺、交联剂和电泳缓冲液进行配制。通过观察电泳胶的形态和孔隙度可以判断电泳胶的浓制。通过观察电泳胶的形态和孔隙度可以判断电泳胶的浓度是否适宜。度是否适宜。测定对象测定对象蛋白质蛋白质DNA/RNADNA/RNA蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质分离效果分离效果高分辨率、灵敏度高分辨率、灵敏度分辨率低于分辨率低于SDSPAGESDSPAGE二级电泳，分辨率高二级电泳，分辨率高根据根据pHpH值分离值分离操作难度操作难度操作流程繁琐操作流程繁琐操作流程较为简单操作流程较为简单操作流程复杂操作流程复杂操作流程繁琐操作流程繁琐SDSPAGE电泳测定和其他方法的比较方法方法SDSPAGESDSPAGE常规常规PAGEPAGE2D PAGE2D PAGEIEFIEFSDSPAGE电泳测定的应用领域SDSPAGE电泳测定已广泛应用于生命科学领域，包括分子生物学、生物化学、免疫学、药物研究等。其能够对蛋白质样品进行分离和定量，并且对蛋白质的分子量、电荷等特性进行分析，具有高分辨率、高敏感度的特点。0202第2章 样品制备 细胞蛋白样品制细胞蛋白样品制备备细胞破碎是制备细胞蛋白样品的关键步骤。可以使用超声细胞破碎是制备细胞蛋白样品的关键步骤。可以使用超声波、高压等方法，常规方法是使用离心机甩掉细胞碎片，波、高压等方法，常规方法是使用离心机甩掉细胞碎片，在离心上清液中检测蛋白含量，然后进行样品处理。在离心上清液中检测蛋白含量，然后进行样品处理。细胞破碎方法利用超声波机械振荡超声波法利用高压融合细胞高压法通过离心将细胞碎片分离离心法 蛋白含量检测方法通过显色反应检测蛋白含量BCA法利用荧光显色检测蛋白含量Lowry法通过染色反应检测蛋白含量Bradford法 样品处理防止蛋白酶降解蛋白质加入蛋白酶抑制剂去除蛋白质中的二硫键加入还原剂增加蛋白质在凝胶上的扩散系数加入凝胶助剂 离心去除细胞碎片血清处理方法0103 02利用SDS-PAGE进行分离蛋白分离方法样品处理中常见问题及解决方案加入蛋白酶抑制剂蛋白酶降解加入一定量的凝胶助剂凝胶破裂加入还原剂蛋白质变性 样品处理中需注意的细节根据样品类型进行调整离心速度和时间根据实验需要选择合适的检测方法蛋白含量的选择在-80条件下储存样品存储 组织蛋白样品制组织蛋白样品制备备组织破碎是制备组织蛋白样品的关键步骤。可以使用超声组织破碎是制备组织蛋白样品的关键步骤。可以使用超声波、高压等方法，常规方法是将组织切片后使用离心机甩波、高压等方法，常规方法是将组织切片后使用离心机甩掉细胞碎片，在离心上清液中检测蛋白含量，然后进行样掉细胞碎片，在离心上清液中检测蛋白含量，然后进行样品处理。品处理。T T细胞细胞产生细胞因子产生细胞因子辅助免疫应答辅助免疫应答肝细胞肝细胞产生血浆蛋白产生血浆蛋白合成胆汁酸合成胆汁酸胰岛细胞胰岛细胞产生胰岛素产生胰岛素调节血糖水平调节血糖水平不同细胞类型产生的蛋白特点比较B B细胞细胞分泌抗体分泌抗体产生产生IgGIgG、IgMIgM等免疫球蛋白等免疫球蛋白 0303第3章 SDS-PAGE胶的制备 胶的选择聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖混合胶、聚丙烯酰胺-牛血清白蛋白混合胶等胶的种类根据样品大小、分离范围、分离效率和分辨率等因素选择合适的胶。胶的选择不同厂家的胶不同，根据实验室的具体情况选择合适的胶。胶的选择 胶的制备生物大分子聚丙烯酰胺、交联剂、离子类/非离子类界面活性剂等胶的成分离子型聚丙烯酰胺凝胶、非离子型聚丙烯酰胺凝胶等，具体制备方法需要根据不同的胶进行调整。胶的制备方法胶的厚度影响着样品分离的大小范围，胶的厚度需要根据实验样品的大小选择。确定胶的厚度 胶的保存和使用将胶封存于密封袋中存放于阴凉干燥处，避免阳光直射。胶的保存方法胶需要在一定温度下膨胀后使用，使用前需要预热。胶的使用时注意事项能否再利用需要根据实验情况而定，如果胶的质量正常，没有裂缝等情况，可以再利用。胶的再利用方法 胶的质量控制通过质量控制方法可以判断胶的成分和性能是否符合要求。胶的质量控制方法胶的质量评估标准需要根据实验室的要求和胶的种类进行调整。胶的质量评估标准胶的常见问题包括胶表面有裂缝、胶还有未固化的部分等，在实验中需要及时解决。胶的常见问题及解决方案 如何制备如何制备SDS-SDS-PAGEPAGE胶胶?SDS-PAGESDS-PAGE是常用的生物分子分离技术，需要通过制备是常用的生物分子分离技术，需要通过制备胶来进行。胶的制备需要根据实验室的具体情况选择合适胶来进行。胶的制备需要根据实验室的具体情况选择合适的胶，并根据胶种类和样品大小调整胶的成分和厚度。制的胶，并根据胶种类和样品大小调整胶的成分和厚度。制备好的胶需要在规定的温度下进行膨胀后使用，使用前需备好的胶需要在规定的温度下进行膨胀后使用，使用前需要预热。制备好的胶需要存放于阴凉干燥处，避免阳光直要预热。制备好的胶需要存放于阴凉干燥处，避免阳光直射。射。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺-琼琼脂脂糖糖混合胶混合胶优点：薄胶具有较高的分离效优点：薄胶具有较高的分离效率率缺点：薄胶分辨率不够高缺点：薄胶分辨率不够高聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺-牛牛血血清清白蛋白混合胶白蛋白混合胶优点：薄胶分离效率和分辨率优点：薄胶分离效率和分辨率都高都高缺点：制备过程复杂缺点：制备过程复杂其他胶其他胶优点：根据实验需求选择不同优点：根据实验需求选择不同的胶的胶缺点：胶的制备和使用会有一缺点：胶的制备和使用会有一定难度定难度胶的选择比较聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶优点：分离范围广，分辨率高优点：分离范围广，分辨率高缺点：薄胶不够精细，分离时缺点：薄胶不够精细，分离时间长间长SDS-PAGE技术应用SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小将蛋白质分离出来，用于分离纯化蛋白质。蛋白质分离通过改变胶的成分，可以将DNA/RNA分离出来，用于纯化DNA/RNA。DNA/RNA分离根据标准蛋白的SDS-PAGE电泳结果可以测定未知蛋白的分子量。分子量测定可以通过在凝胶中添加特定的染料来分析糖蛋白。糖蛋白分析准备好胶的材料，包括聚丙烯酰胺、交联剂、离子类/非离子类界面活性剂等准备工作0103将制备好的胶倒入胶板中，在胶上放置蚊子线，使胶板保持一定的厚度浇铸胶02将材料按照一定比例混合，加水后进行加热、搅拌、分装等步骤制备胶制备胶总结SDS-PAGE电泳测定是常用的生物分离技术，胶的制备是这个技术的关键步骤之一。根据实验室的需求选择合适的胶并进行制备，需要注意胶的选择、成分、厚度、保存和使用等方面。胶的质量控制可以通过质量控制方法来进行，根据标准蛋白的SDS-PAGE电泳结果可以测定未知蛋白的分子量。SDS-PAGE技术应用广泛，适用于蛋白质分离、DNA/RNA分离、分子量测定等场景。0404第4章 SDS-PAGE电泳操作 样品加载前的准备包括去除离心液、纯化液等杂质样品预处理根据需要确定加样量样品加样量的选择将样品和加样缓冲液混合加样样品混合液的制备 电泳胶的预处理包括加热、溶解等胶的预处理方法检查胶的均匀性电泳胶的均匀性检查确定合适的预电泳条件胶的预电泳条件选择 电泳操作包括电场强度、时间等参数的选择电泳条件选择包括样品加载、电泳过程中的注意事项电泳操作注意事项包括洗胶、染色、成像等步骤电泳结束后的处理方法 检查加样量是否正确，检查电路是否断开等电泳不出条带0103可能由于胶的质量不好，电泳时间过长等条带断裂02可能由于电泳时间过长，电场强度过高等条带模糊SDS-PAGESDS-PAGE电电泳泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳是一种用于分离蛋白质的方法，通过电电泳是一种用于分离蛋白质的方法，通过电泳将蛋白质分离出来，然后通过染色和成像等步骤对蛋白泳将蛋白质分离出来，然后通过染色和成像等步骤对蛋白质进行定量和定性分析。质进行定量和定性分析。SDS-PAGE电泳的特点能够将蛋白质分离出来分离效果好只需要一些基本的实验室设备即可操作简单由于重复性好，结果比较可靠结果可靠被广泛应用于生命科学领域应用广泛SDS-PAGE电泳胶的制备SDS-PAGE电泳胶的制备主要包括胶的预处理、胶的熔化、胶的浇注和胶的凝固等步骤。在制备电泳胶的过程中，需要注意胶的预处理方法和胶的均匀性检查，以确保最终的电泳结果。分离效果分离效果SDS-PAGESDS-PAGE电泳：分离效果好电泳：分离效果好等电点电泳：分离效果较差等电点电泳：分离效果较差重复性重复性SDS-PAGESDS-PAGE电泳：重复性好电泳：重复性好等电点电泳：重复性较差等电点电泳：重复性较差应用应用SDS-PAGESDS-PAGE电泳：被广泛应用电泳：被广泛应用于生命科学领域于生命科学领域等电点电泳：在特定领域有应等电点电泳：在特定领域有应用用SDS-PAGE电泳与其他电泳方法的比较原理原理SDS-PAGESDS-PAGE电泳：利用电泳：利用SDSSDS改改变蛋白质的电荷，使得所有蛋变蛋白质的电荷，使得所有蛋白质在电场中具有相同的电荷白质在电场中具有相同的电荷密度密度等电点电泳：利用蛋白质的等等电点电泳：利用蛋白质的等电点进行分离电点进行分离 0505第5章 显色和成像 显色方法荧光染色、银染色等染色方法去色剂、硝基蓝等去染色方法染色时间、染色剂浓度等染色方法的质量控制 成像方法紫外线照射、激光扫描等成像方法比较根据染色方法、成像设备等选择成像方法的选择时间、曝光、灰度等成像质量的控制 结果分析Rf值、相对分子质量等常见的SDSPAGE电泳结果分析方法曲线拟合、数据统计等数据处理方法误差来源、结果比较等结果解析注意事项 结果的处理和保存扫描、拍照等结果的数字化亮度对比、分析软件等结果的图像处理文件格式、存储介质、备份等结果的保存方法及注意事项 照射时间、灰度调整紫外线照射0103曝光时间、ISOCCD相机02扫描速度、分辨率激光扫描染色剂浓度染色剂浓度浓度过低导致信号不清晰浓度过低导致信号不清晰浓度过高导致背景噪音浓度过高导致背景噪音磷磷酸酸缓缓冲冲盐盐溶溶液液pHpH值值pHpH值过低导致电泳缓冲效果差值过低导致电泳缓冲效果差pHpH值过高导致蛋白质电泳迁移值过高导致蛋白质电泳迁移不完全不完全染色后的去色处理染色后的去色处理过度去色会导致信号消失过度去色会导致信号消失不彻底去色会影响结果解析不彻底去色会影响结果解析染色方法的质量控制染色时间染色时间时间过长导致色带变宽时间过长导致色带变宽时间不足导致信号弱时间不足导致信号弱数据处理方法曲线拟合方法是SDS-PAGE电泳分析常用的数据处理方法之一，其目的是找到电泳峰的中心位置和峰的面积。曲线拟合可以通过多种数学模型完成，如高斯分布、洛伦兹分布等。在确认峰的位置和面积后，可以计算出样品的Rf值、相对分子质量等参数。结果的保存方法结果的保存方法及注意事项及注意事项SDS-PAGESDS-PAGE电泳结果可以通过扫描、摄像等方式数字化电泳结果可以通过扫描、摄像等方式数字化保存，在电脑上进行图像处理和数据分析。保存结果需要保存，在电脑上进行图像处理和数据分析。保存结果需要注意文件格式、存储介质、备份等问题，以免造成数据损注意文件格式、存储介质、备份等问题，以免造成数据损失或泄露。失或泄露。0606第6章 总结和展望 SDSPAGE电泳测定在基因分型、蛋白质表达等方面的应用生物技术研究0103 02SDSPAGE电泳测定在疾病诊断和治疗中的应用医学与临床诊断SDSPAGE电泳测定技术的发展趋势SDSPAGE电泳测定与其他高通量技术整合，提高分析效率高通量技术SDSPAGE电泳测定的多维技术应用，增加分析维度多维技术SDSPAGE电泳测定与微流控技术结合，降低样品消耗，提高分辨率微流控技术SDSPAGE电泳测定与自动化技术结合，提高分析效率自动化技术SDSPAGE电泳测定在基因分型、蛋白质表达等方面的应用生物技术研究0103 02SDSPAGE电泳测定在疾病诊断和治疗中的应用医学与临床诊断缺点缺点仪器设备昂贵仪器设备昂贵操作复杂操作复杂易受样品影响易受样品影响改进方向改进方向降低成本降低成本简化操作简化操作提高分析效率提高分析效率应用前景应用前景生物技术研究生物技术研究医学与临床诊断医学与临床诊断食品安全和环境监测食品安全和环境监测SDSPAGE电泳测定技术的优缺点优点优点灵敏度高灵敏度高分辨率高分辨率高适用广泛适用广泛SDSPAGE电泳测定在生物技术和医学领域的实际应用SDSPAGE电泳测定作为一种分离和分析蛋白质的常用技术，被广泛应用于生物技术和医学领域。在生物技术研究方面，SDSPAGE电泳测定被用于蛋白质表达、分型、纯化等方面；在医学和临床诊断方面，SDSPAGE电泳测定被用于疾病诊断和治疗，如血液病的诊断和治疗等。再会！