细胞化学染色法省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

细胞化学染色细胞化学染色第1页一、概念一、概念 细胞学和化学相结合一门科学。以细胞学和化学相结合一门科学。以细胞形态学为基础，结合利用化学反应细胞形态学为基础，结合利用化学反应原理对血细胞内各种化学物质（酶类、原理对血细胞内各种化学物质（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析方法。定性、定位、半定量分析方法。第2页二、临床应用二、临床应用辅助判断急性白血病细胞类型辅助判断急性白血病细胞类型 仅从细胞形态学观察白血病诊疗正仅从细胞形态学观察白血病诊疗正确率约确率约50-70%，如结合细胞化学染色则，如结合细胞化学染色则可提到可提到90%以上。以上。辅助血液系统等疾病诊疗和判别诊疗辅助血液系统等疾病诊疗和判别诊疗观察疾病疗效和预后观察疾病疗效和预后发病机制探讨发病机制探讨第3页三、基本步骤三、基本步骤固定固定显示显示复染复染第4页固固 定定目：保持细胞结构及化学成分不变。方法：物理法 干燥、火焰固定化学法 蒸汽固定、液体固定 （甲醛、乙醇、丙酮等）第5页显示显示偶氮偶联法偶氮偶联法联苯胺法联苯胺法普鲁士蓝反应普鲁士蓝反应雪夫反应雪夫反应金属沉淀法金属沉淀法第6页复复 染染目：使各种细胞显示出来便于观察染核：中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等染浆：伊红、刚果红、光绿等第7页四、种类四、种类过氧化物酶染色过氧化物酶染色、苏丹黑染色苏丹黑染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过碘酸过碘酸-雪夫反应雪夫反应-醋酸奈酚醋酸奈酚酯酯酶酶染色染色酸性磷酸酸性磷酸酶酶染色染色铁铁染色染色第8页过氧化物酶染色过氧化物酶染色(POX)过氧化物酶：过氧化物酶：是中性粒细胞含量最多一个酶是中性粒细胞含量最多一个酶 主要存在于线粒体和溶酶体中主要存在于线粒体和溶酶体中 主要功效是破坏生物氧化过程中有剧毒主要功效是破坏生物氧化过程中有剧毒过氧化物，使其放出氧，参加细胞内氧过氧化物，使其放出氧，参加细胞内氧化还原过程。化还原过程。第9页原理原理Washburn 法法四甲基联苯胺法四甲基联苯胺法改良改良pereira 染色法染色法第10页四甲基联苯胺法四甲基联苯胺法H2O2溶酶体颗粒溶酶体颗粒中中H2OO2四甲基联苯胺四甲基联苯胺O2联苯胺蓝联苯胺蓝联苯胺蓝亚硝基铁氰化钠联苯胺蓝亚硝基铁氰化钠O2蓝色物质蓝色物质（沉淀）（沉淀）第11页正常细胞染色反应正常细胞染色反应粒细胞系统粒细胞系统原粒（可为阴性）分叶（阳性程原粒（可为阴性）分叶（阳性程度逐步增强）度逐步增强）嗜酸阳性最强嗜酸阳性最强嗜碱阴性嗜碱阴性单核细胞系统阴性或弱阳性，（颗粒单核细胞系统阴性或弱阳性，（颗粒少而细）少而细）其它细胞阴性其它细胞阴性第12页第13页第14页临床评价：临床评价：辅助诊疗急性白血病细胞类型首辅助诊疗急性白血病细胞类型首选、最主要细胞化学染色。选、最主要细胞化学染色。第15页、帮助判别诊疗急性白血病类型、帮助判别诊疗急性白血病类型急性粒细胞白血病：急性粒细胞白血病：原粒可呈阳性原粒可呈阳性(粗大，不足分布），粗大，不足分布），阴性不可排除。阴性不可排除。急性淋巴细胞白血病：急性淋巴细胞白血病：要求阳性率。要求阳性率。急性单核细胞白血病：急性单核细胞白血病：原单可为阴性，少数可弱阳性，（少而细原单可为阴性，少数可弱阳性，（少而细小，常弥散分布）小，常弥散分布）。第16页第17页第18页急性早幼粒细胞白血病与急性单核细胞急性早幼粒细胞白血病与急性单核细胞白血病判别白血病判别AML-M3 强阳性强阳性 组织细胞白血病、恶性组织细胞病与急组织细胞白血病、恶性组织细胞病与急单单前二者阴性前二者阴性第19页2.成熟中性粒细胞过氧化物酶活性改变成熟中性粒细胞过氧化物酶活性改变活性增高：再生障碍性贫血、感染、急活性增高：再生障碍性贫血、感染、急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病病活性减低：急粒、慢粒、急单、活性减低：急粒、慢粒、急单、MDS、放射病、退化性中性粒细胞放射病、退化性中性粒细胞第20页苏丹黑染色苏丹黑染色原理：能溶解于细胞内含脂结构中，使原理：能溶解于细胞内含脂结构中，使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。正常细胞染色反应同（染色）正常细胞染色反应同（染色）临床评价临床评价染色特异性高于染色染色特异性高于染色染色敏感性高于染色染色敏感性高于染色第21页中性粒细胞碱性磷酸酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色（）（）原理：中性粒细胞胞质中原理：中性粒细胞胞质中碱性磷酸酶碱性磷酸酶在在PH9.6碱性条件下碱性条件下能水解能水解磷酸奈酚钠磷酸奈酚钠底底物，生成物，生成奈酚奈酚，后者与，后者与偶氮盐偶氮盐偶联形成偶联形成不溶性有色沉淀定位于胞质中酶活性处。不溶性有色沉淀定位于胞质中酶活性处。第22页中性粒细胞碱性磷酸酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色（）原理：原理：磷酸奈酚钠底物磷酸奈酚钠底物 PH9.6 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(中性粒细胞胞质中中性粒细胞胞质中)奈酚奈酚+偶氮盐偶氮盐 (有色沉淀有色沉淀)第23页正常血细胞染色反应正常血细胞染色反应 NAP主要存在于中性成熟粒细胞主要存在于中性成熟粒细胞(杆状杆状分叶分叶)第24页第25页第26页第27页参考值：成人参考值：成人NAP阳性率阳性率10%-40%；NAP积分积分 40-80分分第28页积分增加：积分增加：细菌性感染细菌性感染、再生障碍性贫血再生障碍性贫血、骨骨髓增殖性疾病髓增殖性疾病、慢性粒细胞白血病（加、慢性粒细胞白血病（加速期、急变期）、急性淋巴细胞白血病、速期、急变期）、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨慢性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移癌、肾上腺糖皮质激素及雄激素髓转移癌、肾上腺糖皮质激素及雄激素治疗后等。治疗后等。第29页积分下降：积分下降：慢性粒细胞白血病（慢性期）、阵发性慢性粒细胞白血病（慢性期）、阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合症、恶性组织细胞病等。症、恶性组织细胞病等。第30页疾病判别疾病判别1.类白血病反应慢性粒细胞性白类白血病反应慢性粒细胞性白血病血病2.细菌性感染病毒性感染细菌性感染病毒性感染3.急粒急淋急粒急淋4.恶性淋巴瘤恶性组织细胞病恶性淋巴瘤恶性组织细胞病第31页5.恶性组织细胞病反应性组织细胞增多恶性组织细胞病反应性组织细胞增多症症6.真性红细胞增多症继发性红细胞增真性红细胞增多症继发性红细胞增多症多症7.原发性血小板增多症继发性血小板原发性血小板增多症继发性血小板增多症增多症8.再生障碍性贫血再生障碍性贫血 阵发性睡眠性血红蛋阵发性睡眠性血红蛋白尿白尿第32页过碘酸过碘酸-雪夫反应雪夫反应原理：原理：乙二醇基（多糖类物质中）乙二醇基（多糖类物质中）过碘酸过碘酸双醛基无色品红双醛基无色品红紫红色化合物紫红色化合物第33页正常血细胞染色反应正常血细胞染色反应粒细胞系统粒细胞系统原粒原粒（可为阴性）（可为阴性）分叶（阳性程度逐步增分叶（阳性程度逐步增强）强）嗜酸胞质呈红色嗜酸胞质呈红色,颗粒不着色颗粒不着色嗜碱反之嗜碱反之红细胞系统红细胞系统 阴性阴性单核细胞系统单核细胞系统 原单原单（可为阴性）（可为阴性）,其它为阳性。其它为阳性。第34页第35页第36页淋巴：大多阴性，少数阳性。淋巴：大多阴性，少数阳性。巨核及血小板：阳性巨核及血小板：阳性第37页临床评价临床评价红血病、红白血病、骨髓增生异常综合红血病、红白血病、骨髓增生异常综合征中幼红细胞可阳性（均匀红色或块状）征中幼红细胞可阳性（均匀红色或块状）白细胞系统疾病：白细胞系统疾病：急淋：（原幼淋细胞阳性率升高，呈粗急淋：（原幼淋细胞阳性率升高，呈粗颗粒或块状）颗粒或块状）急粒：少数原粒呈阳性急粒：少数原粒呈阳性 急单：可呈阳性急单：可呈阳性第38页第39页M5 PAS(+)第40页AML-M6第41页第42页AML-M7第43页M7 PAS(+)第44页第45页第46页第47页-醋酸醋酸萘萘酚酚酯酯酶酶染色染色原理原理 -醋酸醋酸萘萘酚酚 PH中性中性 -醋酸醋酸萘萘酚酚酯酯酶酶 -萘萘酚酚+重氮重氮盐盐(坚坚牢牢蓝蓝B)(黑色或灰黑色黑色或灰黑色)第48页正常血正常血细胞染色反胞染色反应单核核细胞、粒胞、粒细胞、淋巴胞、淋巴细胞（均可胞（均可+）单核核细胞阳性可被氟化胞阳性可被氟化钠抑制。抑制。氟化氟化钠抑制率抑制率=抑制前阳性率抑制前阳性率/积分分-抑制后抑制后 抑制前阳性率抑制前阳性率/积分分 100%第49页临床评价：临床评价：1、判别白血病类型、判别白血病类型急单急单急粒急粒急性早幼粒细胞白血病（强阳性，不急性早幼粒细胞白血病（强阳性，不被抑制）被抑制）急性粒单细胞白血病急性粒单细胞白血病第50页其它脂酶染色其它脂酶染色氯乙酸氯乙酸AS-D奈酚脂酶染色奈酚脂酶染色 几乎仅出现在粒细胞、特异性高。几乎仅出现在粒细胞、特异性高。临床意义：临床意义：急性粒细胞白血病有一定数量白血病细胞急性粒细胞白血病有一定数量白血病细胞阳性，能够必定白血病细胞中有粒系成份，阳性，能够必定白血病细胞中有粒系成份，阴性不排除急粒。阴性不排除急粒。第51页醋酸醋酸AS-D萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色 染色结果染色结果、临床意义基本同、临床意义基本同-NAE染色。染色。-丁酸丁酸萘萘酚酚酯酯酶酶染色染色 临临床意床意义义同同-NAE染色，特异性低于染色，特异性低于-NAE染色染色第52页酸性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色原理：原理：偶氮偶联法：偶氮偶联法：Gomori硫化铅法硫化铅法抗酒石酸酸性磷酸酶染色抗酒石酸酸性磷酸酶染色第53页第54页第55页临床评价：临床评价：诊疗多毛细胞白血病诊疗多毛细胞白血病 毛细胞呈阳性，阳性反应不被毛细胞呈阳性，阳性反应不被L-酒石酒石酸抑制。酸抑制。第56页第57页铁染色铁染色1、原理：、原理：铁铁+亚铁氰化钾亚铁氰化钾酸性环境酸性环境 亚铁氰化铁（兰色）亚铁氰化铁（兰色）第58页2、正常血细胞染色反应、正常血细胞染色反应贮存铁部位：巨噬细胞和幼红细胞贮存铁部位：巨噬细胞和幼红细胞细胞外铁细胞外铁：骨髓小粒巨噬细胞中：骨髓小粒巨噬细胞中呈弥散蓝色、颗粒状、小珠状或块状呈弥散蓝色、颗粒状、小珠状或块状可将细胞外铁分为（可将细胞外铁分为（-）、（）、（+）、）、（+）（）（+）、（）、（+）。）。第59页细胞内铁细胞内铁：指存在于中幼红、晚幼红、：指存在于中幼红、晚幼红、成熟红细胞中铁。成熟红细胞中铁。铁粒幼红细胞铁粒幼红细胞：胞质中出现蓝色铁颗粒：胞质中出现蓝色铁颗粒幼红细胞。幼红细胞。环形铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞：幼红细胞胞质内蓝色：幼红细胞胞质内蓝色颗粒在颗粒在 10(6)颗以上，围核周颗以上，围核周2/3(1/2)以以上者。上者。第60页第61页第62页细胞外铁细胞外铁第63页细胞内铁细胞内铁第64页环形铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞第65页结果判读：结果判读：细胞外铁：细胞外铁：可分五级标准可分五级标准 (-)：无颗粒：无颗粒 (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积颗粒体积大于嗜酸性粒细胞颗粒者称为铁珠大于嗜酸性粒细胞颗粒者称为铁珠)。(+)：有较多铁颗粒和小珠。：有较多铁颗粒和小珠。(+)：有很多铁颗粒、小珠和少数小块状。：有很多铁颗粒、小珠和少数小块状。(+)：有极多铁颗粒、小珠，有很多小块，：有极多铁颗粒、小珠，有很多小块，密集成堆。密集成堆。第66页 细胞内铁：细胞内铁：用油镜计数用油镜计数100个中、晚幼红细胞，统计胞浆个中、晚幼红细胞，统计胞浆中含有蓝色铁粒细胞中含有蓝色铁粒细胞(铁粒幼红细胞铁粒幼红细胞)百分率。百分率。依据细胞内铁颗粒数目、大小、染色深浅和颗依据细胞内铁颗粒数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型：粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型：I 型：幼红细胞内含铁粒型：幼红细胞内含铁粒1-2粒；粒；型：幼红细胞内含铁粒型：幼红细胞内含铁粒3-5粒；粒；型：幼红细胞内含铁粒型：幼红细胞内含铁粒610粒；粒；型：幼红细胞内含铁粒型：幼红细胞内含铁粒10粒。粒。第67页参考范围参考范围：细胞外铁细胞外铁：（+）（）（+）细胞内铁：铁粒幼红细胞细胞内铁：铁粒幼红细胞12%44%，以，以型为主，少数为型为主，少数为型。型。第68页3、临床评价：、临床评价：缺铁性贫血缺铁性贫血 骨髓细胞外铁显著降低，骨髓细胞外铁显著降低，“一一”“士士”，细胞内铁平均，细胞内铁平均5.9%，仅为，仅为I型。型。铁粒幼细胞性贫血铁粒幼细胞性贫血 外铁外铁“2”一一“3”，内铁平均，内铁平均70%，其铁粒粗大，以，其铁粒粗大，以 型为主，出现型为主，出现较多环形铁粒幼细胞。较多环形铁粒幼细胞。骨髓增生异常综合症骨髓增生异常综合症 第69页