KJWI-QA-25菌落总数测定方法作业指导书 (1).docx

文件修改记录版本修订 次数修订日期修订内容002011-02-01A12012-05-25修订分发号：（仅适用于控制文件） （仅盖有红色印章的文件才有效）1.0目的规定菌落总数的测定方法。2.0范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁、原辅材料、流程卫生中菌落总数的检测。3. 0术语4. 1菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得 每g （mL）检样中形成的微生物菌落总数。5. 0职责质检部：负责按此方法对加多宝凉茶、浓缩汁、原辅材料、流程卫生中菌落总数进行检测。5. 0工作流程图见附录A6.0内容及要求6.1 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：6.1.1 恒温培养箱：36±1> 55±1 （必要时可选用）6. 1.2 冰箱:257. 1.3恒温水浴锅：46±18. 1. 4天平：感量0. 1g9. 1. 5 pH 计6. 1.6无菌吸管：1ml （具0.01刻度）、5ml （具0.05刻度）、10ml （具0.1刻度）。7. 1.7无菌锥形瓶：容量250ml、500ml8. 1.8 无菌试管:18 X 200mm9. 1.9无菌培养皿：直径90nm10. 1. 10放大镜11. 2培养基和试剂11.1.1 板计数琼脂培养基。11.1.2 75%乙醇溶液。6. 2. 3无菌生理盐水：称取8. 5g氯化钠溶于1000ml蒸屈水中121c高压灭菌15mino6. 3操作步骤6. 3.1样品的稀释6.3. 1. 1固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min均质1 min2 min,或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍 击式均质器拍打1 min2 min,制成1:10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶 内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌 吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按6. 3. 1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可 包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两 个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6. 3. 1.6及时将15 mL20 mL冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ±1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6. 3. 2培养6. 3. 2. 1待琼脂凝固后将平板翻转，36c±1 培养48 h±2或55±1 培养48 h±2。6. 3. 2. 2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面 覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL）,凝固后翻转平板，按6. 3. 2.1条件进行培养。6. 3. 3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形 成单位 （colony-forming units, CFU） 表示。6. 3. 3. 1选取菌落数在30 CFU300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数 应采用两个平板的平均数。6. 3. 3. 2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即 可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6. 3. 3. 3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。6. 3. 4结果与报告6. 3. 4.1菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平 均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g （mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： N= EC/ （ni+O. ln2） d （1）式中：N样品中菌落数；EG-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；m第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2-第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度1:100 （第一稀释度）1:1000 （第二稀释度）菌落数232, 24433, 35N= EC/ （nt+O. ln2） d=（232+244+33+35） / （2+0. 1X2） X10-2=544/0.022=24727上述数据按6. 3. 4. 2. 2数字修约后，表示为25000或2. 5X10%6. 3.4. 1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU,则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以 稀释倍数计算。6. 3. 4. 1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀 释倍数计算。6. 3. 4. 1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU-300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6. 3. 4. 2菌落总数的报告6. 3. 4. 2. 1菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。6. 3. 4. 2. 2菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。6. 3. 4. 2. 3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7. 3. 4. 2. 4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。8. 3. 4. 2. 5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。9. 0相关文件无10. 0质量记录8. 1 KJWIF-QA-34成品检测记录8.2 KJWIF-QA-33成品微生物检验报告附录A：菌落总数检验程序