家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究应用.doc

项目名称：家蚕核心品质性状分子解析及分子育种基本研究首席科学家：夏庆友 西南大学起止年限：.1-.8依托部门：重庆市科委 教诲部一、核心科学问题及研究内容1拟解决核心科学问题 依照国家蚕丝产业发展重大需求和蚕业科学发展长远需要，以“十一·五”家蚕“973”项目研究为基本，“十二·五”期间紧扣家蚕核心品质性状，重点解决如下两个核心科学问题： 第一：家蚕核心品质性状形成分子机理 家蚕因食桑产丝，才可供人类运用，其核心品质性状重要有三：第一，丝蛋白合成与分泌机制。丝蛋白构成和构造特性，决定了蚕丝核心品质性状。研究表白，家蚕丝各种工艺性状，涉及纤度（茧丝直径）、茧丝长度、净度（茧丝表面构造）、强伸力、抱合力以及解舒性能（丝胶溶解性）等，均受丝腺合成与分泌机制所调控；第二，发育变态与调控。家蚕是典型完全变态昆虫，现行蚕桑生产体系，无不是依照家蚕生长与变态发育特性来安排。特别重要是，家蚕生长与发育特性（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量，整体上决定了家蚕蚕丝生产特性；第三，对疾病抵抗性。家蚕通过数千年人工驯化，尽管获得了适合群居饲养和发育整洁等有助于生产特性，同步也有大规模易受病原微生物感染不利性状。尽管蚕桑生产过程中疾病防控受到高度注重，但每年蚕农因蚕感病导致损失依然高达25，并且高居不下。上述三个生理过程（或性状），是家蚕诸多影响蚕丝产量和品质中最为核心且互相联系因素，决定了蚕丝生产整体水平与效益，是本项目将要解决第一核心科学问题。 在前一种项目中，家蚕性别决定、丝蛋白合成、发育和免疫等四大性状是作为其中一种课题来布局，并打开了核心突破口。本期项目把性别决定之外三个性状上升为三个课题，同步布局家蚕干细胞与不同组织器官变态发育过程中分子基本研究，由于干细胞与组织器官再生与家蚕丝腺发育、变态发育和免疫防御有着重要密切关系。依照已有基本，家蚕核心品质性状形成分子机理研究详细科学问题分别如下： 蚕丝蛋白合成机理研究将着重解决丝蛋白基因分子调控问题。家蚕幼虫期共食下鲜桑叶约22g，丝腺合成并分泌约0.5g丝蛋白。研究表白，家蚕丝蛋白合成调控有三大重要特点，一是蚕丝合成高效性：家蚕丝腺功能高度特异化，类似果蝇唾液腺，而丝蛋白质合成重要由数目极其有限（140余个）分泌细胞完毕，这些细胞细胞核内染色体高度多倍化，可达到50100万单倍基因组。二是部位特异性：蚕丝由家蚕体腔内左右对称分布一对丝腺所合成，每条丝腺分前部、中部和后部三个功能区域，后部和中某些别特异合成家蚕丝素蛋白和丝胶蛋白等茧丝纤维重要构导致分；这种部位特异性决定了蚕丝各组分，特别是有效组分丝纤维所占比例和加工特性。三是时间特异性：家蚕丝腺细胞分化于胚胎发育时期，尽管初期幼虫蜕皮期可以合成少量蚕丝蛋白，但大量合成丝蛋白并形成丝纤维却是在末龄幼虫第3天开始，具备严格时间调控。因而，阐明蚕丝品质性状机理，重要科学内涵是回答上述三个特性分子调控机制。前期研究表白，丝蛋白编码基因转录和翻译机制是决定丝蛋白合成机制核心因素。通过丝腺特异基因大规模鉴定和功能研究，初步发现丝蛋白编码基因受两大信号通路调控。一是激素信号通路，重要调控基因转录时间特异性；二是受发育主控基因，即高度保守同源异型盒（Homeobox）类转录调控因子所调控，重要决定丝蛋白基因表达空间特异性。为此，本期项目将重点研究fib-H、fib-L、P25和Ser13等重要丝蛋白编码基因受激素信号和发育主控基因调节机制，以期系统阐明丝蛋白合成分子机理及其与蚕丝品质之间互有关系。 激素和营养信号传导与变态发育调控研究着重解决信号传导机制。与其他全变态昆虫同样，家蚕变态发育重要受激素（神经肽激素、蜕皮激素、保幼激素和类胰岛素等）和营养（氨基酸、糖和脂肪酸等）协同调控。当前懂得，当家蚕从一种龄期幼虫向下一种龄期幼虫转变时，往往同步有高水平蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）分泌，使得昆虫不会发育成蛹或成虫（蛾）。而在幼虫向蛹期发育时，体内有高水平蜕皮激素，但保幼激素水平下降，使得幼虫向蛹期变态发育。因而以为，蜕皮激素控制着昆虫蜕皮与变态发育进程；而保幼激素则调控着昆虫发育方向。因此，蜕皮激素和保幼激素信号传导系统及其互相作用是变态发育核心问题。而家蚕生长与发育特性（例如个体大小、蜕皮和化蛹时期、成虫孵化时期）决定了蚕丝蛋白合成时期与合成量。因而，激素和营养信号传导对变态发育调控将极大地影响着蚕丝产量和品质。本项当前期研究发现，家蚕共计有87种神经肽激素、激素受体和激素调节有关基因；鉴定出18种对20E敏感受体和受体型转录因子。此外，神经肽激素基因，涉及滞育激素（DH）、信息素生物合成激活神经肽（PBAN）、脂动激素（AKH）、羽化激素和家蚕素（4K-PTTH）基因也被鉴定。在前一期项目重点开展了家蚕JH和20E合成代谢途径及信号传导途径有关基因鉴定和功能初探基本上，本期项目将以丝腺、脂肪体、中肠和表皮等组织器官为重要研究材料，重点研究昆虫变态发育激素信号传导重要途径和核心调控分子作用，揭示激素与营养信号与组织器官退化和再生关系，建立比较完整家蚕变态发育激素与营养调控理论体系和机理模型，以期阐释昆虫变态发育这一重大科学问题。干细胞与家蚕变态发育组织器官再生机理研究着重解决成虫组织器官形成中干细胞生物学行为变化及调控机制。家蚕变态发育期普通指5龄末期幼虫至成虫羽化阶段，涉及幼虫-蛹和蛹-成虫（蛾）变化过程。在变态过程中，幼虫专性组织如前胸腺、丝腺等迅速退化消灭，中肠、神经和脂肪体发生构造和功能转变，翅原基、胸足原基和生殖腺细胞组织迅速分化生长，并发育为成虫器官组织。关于果蝇研究表白，干细胞在变态发育期各种成虫组织器官分化形成过程中扮演着至关重要角色，受到复杂各种信号分子网络调控。干细胞与组织器官再生不但与变态发育有密切关系，与丝腺发育和免疫防御也有着重要关系。前期研究咱们一方面关注了家蚕中肠干细胞鉴定与分化调节，在筛查家蚕中肠干细胞分子标记和鉴定变态发育过程中家蚕中肠干细胞等方面获得突破进展。本期项目将以中肠、血液、神经、脂肪体、翅原基等组织器官为重要材料，系统研究这些组织器官在家蚕变态发育中分化形成与再生重建干细胞分子基本，鉴定目的组织器官干细胞，揭示干细胞在有关组织器官形成或重建过程中自我维持与分化行为，阐释干细胞分化为有关组织器官分子调控机制，这是在分子细胞生物学水平阐明昆虫变态发育这个重大科学问题核心。 家蚕免疫调节与抗性机理研究将着重解决宿主对病原微生物模式辨认问题。昆虫体液免疫在抵抗病原微生物侵染中发挥着最重要作用。昆虫体液分子免疫系统重要由模式辨认、信号传导和效应因子表达三个某些构成。前期项目重要通过基因组分析和微生物诱导实验，基本查明了家蚕体液免疫信号传导过程核心基因，系统鉴定了家蚕抗菌肽效应因子构成和功能。研究发现，家蚕免疫有关基因和信号传导途径比较保守，与模式生物果蝇Toll和Imd两种先天免疫信号途径应答基本一致，但家蚕效应因子体系与果蝇相比又具备一定特殊性。前期项目还对Toll信号途径中Toll受体、Spätzle、MyD88和Tube等，Imd途径中Imd、FADD、IKK和relish等核心基因进行了进一步研究。作为免疫应答前哨，昆虫病原模式辨认受体是激发免疫信号传导通路和效应因子产生核心。昆虫对不同病原物具备高度特异模式辨认，剖析昆虫病原物模式辨认，也是阐明和提高家蚕抗病性重要靶标。在前期项目系统鉴定信号传导和免疫应答体系基本上，本期项目将重点研究家蚕对不同专有性病原微生物模式辨认分子，以及它们在启动免疫信号通路中详细功能，以期阐明家蚕重要病害形成机制，谋求新防御办法。 丝蛋白合成分子调控作为昆虫特异基因调控研究模式，对昆虫发育和分子生物学基本研究将提供重要补充作用；激素信号与变态发育调控、干细胞与变态发育组织器官再生机理，以及免疫分子机制，更是昆虫基本科学研究前沿和热点。因而，这几种方面科学问题互相联系，不但作为家蚕核心品质性状对蚕丝业生产举足轻重，并且也作为昆虫基本科学重要领域，对整个昆虫学研究发展和害虫防治新方略产生都具备十分重要意义。 第二：家蚕分子育种理论基本与技术体系 在“十一·五”家蚕“973”项目支持下，许多与重要经济性状有关功能基因得到鉴定，遗传素材创新基本平台建设也已经初具规模。系统研究家蚕分子育种理论体系，并建立相应技术平台，哺育高产优化家蚕品系，成为下一种五年筹划必须解决重点问题。 家蚕分子育种理论体系亟需着重解决分子改良靶标和实现思路。家蚕自野蚕经人工选取和驯化而来，与野蚕祖先相比，家蚕产丝性能提高近10倍。1930年代开始运用一代杂种优势，蚕丝产量比饲养纯种又提高了近20。自此，家蚕生产能力达到了一种难以逾越高峰，使得其后近80年间未见革命性突破。与其他植物或动物生产同样，家蚕品种也正处在分子改良甚至系统分子育种前夜，新突破机遇需要坚实理论基本。既有遗传资源中自身就存在着大量发育、变态和抗性突变系。如前所述三个核心性状中，家蚕激素调节与免疫性状实现分子育种靶标位点相对较多，而蚕丝蛋白合成调节靶标位点相对较少。初步研究成果表白，通过调节丝腺发育和丝蛋白编码基因转录，也许是实现丝产量和品质改良有效路过。本期项目将此前述家蚕几种核心品质性状分子解析为基本，建立家蚕分子育种基本思路和方略，为家蚕品种分子改良奠定坚实理论基本。 家蚕分子育种技术体系着重解决遗传互作和基因敲除技术建立。从基因层面讲，分子育种无外乎有两个技术路过：一是已有基因功能加强甚至新功能导入；二是已有基因功能削弱甚至彻底丧失。通过前期项目研究，建立了比较稳定和有效家蚕转基因技术体系，以及系统RNAi、GAL4/UAS转基因等分子遗传操作办法。但是，从家蚕分子育种技术储备和现实规定而言，还丞需建立和完善遗传互作和基因敲除等核心技术。为此，本期项目将着重解决：克隆不同发育时期和组织器官特异启动子或顺式作用元件，建立各种GAL4转基因系，以实现目基因时空特异转录调控；运用UAS使目基因功能加强或获得新功能，并整合RNAi使目基因功能消弱或丧失；研究建立2个UAS元件控制2个基因遗传操控及其互作：2个基因同步获得功能、2个基因同步丧失功能、1个基因获得功能而另1个基因丧失功能；结合GAL4/UAS转基因和FRT-FLP mosaic技术，建立Flp-out mosaic办法，分析在任一组织、任一发育时期基因获得功能或丧失功能细胞与外周野生型细胞差别。家蚕中至今尚未实现基因有效定向敲除（knock out）和敲入（knock in），本期项目将通过锌指核酸酶等办法建立家蚕基因定向敲除和敲入技术，通过对分子靶标操控实现家蚕基因组有效和定向编辑，为家蚕核心品质性状基因功能研究和分子改良与素材创新搭建核心技术平台。 2重要研究内容 环绕以上两个核心科学问题，筹划从三个方面开展研究：（1）家蚕重要功能基因定位克隆 前期项目已经建立了家蚕突变基因定位克隆平台技术，以此为基本，本期将重点环绕家蚕丝品质、变态发育和抗性性状，定位克隆研究重要突变基因，在布局上将分解到三个品质性状有关课题开展研究。开展此研究重要目在于保持前沿摸索，不断推动家蚕功能基因组研究长期和可持续发展。 （2）家蚕核心品质性状分子解析 从基因层面解析家蚕丝蛋白合成、激素调控与变态发育、干细胞分化与组织器官形成以及分子免疫分子机制，是本项目核心和重点之一。因而在布局上，三个核心性状以及干细胞分化与组织器官形成均单独列为课题开展研究。丝蛋白合成研究将环绕家蚕丝素重链基因（fib-H）、轻链基因（fib-L）、丝胶基因（Ser13）和P25等蚕丝重要构造蛋白编码基因转录调控机理展开，重点研究涉及丝腺细胞发育与功能分化，丝蛋白编码基因表达与激素信号互有关系，丝纤维重要构成蛋白晶体构造解析，各构成蛋白数量和构造与丝纤维加工工艺性状之间关系等内容。家蚕发育激素调控研究将环绕激素信号传导体系展开，重点涉及激素结合蛋白或受体及信号传导途径核心转录因子克隆和功能研究，蜕皮激素和保幼激素信号传导途径核心调控因子互相作用，昆虫激素与营养调节关系，以及激素调节与家蚕旧组织退化和新组织形成之间关系等内容。干细胞与家蚕变态发育组织器官再生机理重点环绕家蚕变态发育中成虫组织器官形成干细胞基本展开，重点涉及家蚕变态发育中特定组织干细胞鉴定，组织器官发生或重建中干细胞自我维持与分化行为，干细胞分化发育与有关组织器官分子调控机制等内容。家蚕分子免疫研究将环绕家蚕对专有病原微生物分子辨认展开，涉及家蚕对重要病原微生物侵染反映及病原辨认因子鉴定，免疫应答及抗微生物肽表达调控，重要病原微生物与宿主互作，以及抗病和抗逆分子基本等内容。 （3）家蚕分子育种理论基本与技术体系研究家蚕分子育种理论基本与技术体系建立是整个项目终极目的和指引方向，在布局上列为两个课题开展研究。理论基本环绕家蚕分子改良分子靶标和实现途径开展研究，重点涉及丝蛋白编码基因上调表达研究，丝腺组织发育分子调控以及与对产丝量影响，家蚕激素信号传导对丝蛋白合成影响，家蚕分子免疫信号调控与疾病抵抗性调节等重要内容，整体上规定明确核心品质性状人为调节也许环节和核心因子，形成家蚕分子育种理论体系。分子育种技术体系环绕家蚕分子遗传操作体系和基因定向敲除技术开展工作，重点涉及运用GAL4/UAS双开关实现目基因时空特异调控，研究2个基因同步调控及其遗传互作，建立Flp-out mosaic技术并分析突变体细胞和野生型细胞差别，运用锌指核酸酶等技术实现家蚕基因定向敲除和基因替代，家蚕基因敲除与转基因技术整合和遗传调控等内容。整体上规定实现可人为干预任何一种靶标基因功能分子育种平台。该两个课题还将运用整个项目产出基本研究成果，创新家蚕遗传素材，哺育新型高产优质和满足特殊需求新品种，推动蚕丝产业整体技术水平和综合效益大幅度提高，为国民经济建设和蚕农增收服务。二、预期目的1总体目的依照国家蚕丝产业发展重大需求和蚕业科学发展长远需要，以“十一·五”家蚕“973”项目研究为基本，“十二·五”期间总体目的是：1）充分挖掘运用家蚕全基因组生物信息学资源和突变资源，环绕核心品质性状，特别是丝蛋白产量和质量性状，克隆或鉴定重要核心基因，解析其调控途径，阐明核心品质性状形成分子机理；2）建立和完善家蚕基因调控和定向敲除等核心平台技术，实现完整功能丧失和功能获得等遗传分析及素材创新必须手段，建立分子育种理论基本和技术体系，创制新型素材，哺育新型品种。总体上规定环绕解决提高蚕丝产量和质量这个详细科学和生产问题，获得系统性和标志性重大理论突破，以推动国内蚕丝产业技术革命，并进一步夯实国内家蚕基本研究国际领先优势，培养造就一批具备国际影响中青年学术带头人和技术骨干。2五年预期目的（1）阐明四个机制，形成一种理论基本，建立一种技术体系：以家蚕基因组和功能基因组学研究成果为基本，通过度子、细胞和个体水平系统研究，阐明家蚕核心品质性状形成分子机制，即家蚕高效特异合成丝蛋白分子调控机制，家蚕激素信号传导途径与变态发育调节机制，家蚕干细胞分化形成成虫组织器官分子机制，家蚕分子免疫系统中病原模式辨认与抗性形成分子机制；通过研究，明确家蚕分子改良核心靶标和方略模型，建立完善家蚕分子育种理论基本；建立涉及基因敲除等在内家蚕基因遗传操控和基因组定向编辑技术，以形成分子育种完整技术体系。整体上将家蚕功能基因组研究深化和拓展到系统性状分子解析与产业应用新阶段。（2）定位克隆至少25个以上重要突变基因，通过功能验证和机理解析揭示新信号通路或调控路过。（3）进一步研究至少25个与丝产量品质、变态发育激素调节、成虫组织干细胞发育分化和抗病性密切有关调控基因，获取15个左右核心顺式作用元件，获得基因专利40项。（4）创制15个以上高产、优质、强健新型遗传素材，哺育2个标志性新蚕品种。（5）出版学术专著3部，在国内外核心刊物刊登论文300篇，其中有重要影响论文50篇以上，并刊登35篇有重要理论突破高水平研究论文；培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次科技新人，其中涉及研究生研究生200名、博士研究生100名和博士后15名。三、研究方案1学术思路 运用家蚕全基因组序列和高精度遗传变异图谱，通过家蚕基因定位克隆、基因敲除和敲入，转基因及RNA干扰等当代分子生物学技术，以家蚕丝蛋白合成、变态发育激素调节、组织器官形成干细胞基本以及分子免疫为目的，系统进一步研究核心基因调控方式和信号传导，解析核心品质性状分子机理；运用GAL4/UAS系统在特定组织特定期间解析特定基因功能和调控；运用锌指核酸酶等技术实现家蚕基因组定向编辑，研究建立家蚕分子育种理论和技术；通过对核心分子靶标遗传操作实现品质性状分子改造、素材创新和品种育成，奠定产业实际应用基本。同步，使家蚕作为鳞翅目模式昆虫研究提高到一种新台阶。 2技术途径 项目总体采用三条重要技术路线：一是精细图谱变异图谱基因定位，二是基因功能调控机理性状形成，三是核心基因素材创新产业应用。详细如下： （1）精细图谱变异图谱基因定位 基于家蚕重测序建立高精度变异图谱，筛选有效SNPs定位标记；制作突变材料作图群体（BF1或F2），运用典型连锁信息和精细图谱，拟定多态型标记；对群体进行分子标记和性状之间连锁分析，逐渐缩短性状连锁区间至最小范畴；运用精细图谱拟定所在区间候选基因，通过表达分析、突变位点分析基因功能拟定突变基因。 （2）基因功能调控机理性状形成 针对不同基因，设计不同技术路线研究基因调控机理：丝蛋白编码基因重要通过生物信息分析筛选候选顺式作用元件，运用DNA蛋白质结合技术鉴定顺式作用元件和转录调控因子，进而摸索转录调控与激素信号等通路之间联系；激素与发育有关基因将重要通过转基因和RNAi等技术，对目的基因进行功能研究和调控分析，以及通过组织和细胞分离与离体转化和培养技术对基因表达调节和功能在分子、细胞、器官和个体水平上进行研究；干细胞发育分化有关基因重要通过荧光示踪鉴定特定组织干细胞和寻找干细胞发育和分化核心节点，结合基因芯片、基因诱捕、生物信息学等技术手段，建立成虫组织干细胞分化调控网络；免疫有关基因重要通过Pull-down等鉴定与病原物结合蛋白，通过基因在细胞或者个体表达调控研究对下游信号通路、抗菌效应因子和病原诱导存活率影响。 （3）核心基因素材创新产业应用 依照家蚕分子育种理论和设计，以piggyBac为载体，实既有用基因正向改良（新功能获得或加强），运用转基因RNAi或者锌指核酸酶技术，实现基因功能反向改良（削弱或者彻底丧失功能），运用转基因技术和GAL4/UAS遗传开关，实现对各种基因同步操作，实现优良性状整合，创制新型素材；通过典型育种程序，选取稳定品系，育成高产优质品种。 总体技术路线如下：3创新点与特色 （1）重要品质性状核心基因作用机理及其调控网络系统性解析 重点抓住蚕产量和品质核心，通过丝编码基因调控机理、变态发育激素调控、成虫组织干细胞发育分化和免疫与抗性四个密切有关课题，系统并进一步解析家蚕重要品质形成核心基因和调控网络。因而，从整体上讲，本项目是在完整基因组生物信息学基本上，将初次实现生物信息学、基因组学和功能基因组学等大规模分析平台与分子生物学、发育生物学和遗传学等分析办法有机结合，高起点、高通量、高效率地解剖决定重要品质性状核心途径机理，将系统地揭示家蚕特有和区别于其他昆虫、动物和植物基因作用方式。 （2）突破分子育种理论和技术核心 其他昆虫（重要是害虫）基本研究重要以控制和防治为目，而本项目重要目的集中于有效运用，具备特殊性。项目将率先建立家蚕分子育种理论和技术体系，实现素材创新和育种。与蚕丝产业技术老式研究相比，具备理论上先进性、技术办法当代性和研究方案高效性，将突破老式育种无法逾越障碍，推动蚕丝业技术革命并奠定长远可持续发展基本。 （3）推动家蚕作为昆虫研究模式发展 项目所重点涉及家蚕丝蛋白合成、发育变态激素调节、成虫组织干细胞发育分化和免疫抗性分子机理研究等内容，在理论上属于昆虫科学前沿性重大科学问题。另一方面，与小鼠、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥等其他模式生物相比，当代昆虫学研究还缺少一种重要模式昆虫，其重要障碍之一是缺少有效、专一、定向和可控基因敲除与敲进等遗传操控技术体系。通过本项目将回答昆虫学前沿科学问题同步，建立家蚕有效遗传操控技术体系，突破家蚕昆虫模式化道路中核心瓶颈，有力推动家蚕这一“中华人民共和国果蝇”基本研究迅速发展。4可行性分析项目承担单位近年来共完毕家蚕有关研究项目70余项，涉及1项“973”项目、10项“863”项目、15项“九·五”和“十·五”重大科技攻关项目、4项国家自然科学基金重点项目和40余个面上项目，完毕了项目基本积累。特别是“十一·五”期间认真执行“973”家蚕项目，至少在三个方面奠定了本项目重要基本：一是集中了全国优势力量，形成紧密分工协作研究框架，通过引进和培养形成了一支强有力研究队伍；二是各个承担单位建设了高水平研究平台，并形成了各自特色和优势；三是完毕了前一期项目各项研究任务，建立了较为完善平台技术，核心性状研究获得了突破。特别是，本期项目及时吸纳了从国外回国华南师范大学冯启理专家和中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所李胜研究员两个先进团队以及多名学术骨干，进一步加强了老式家蚕研究力量与模式昆虫（果蝇）和害虫防治研究力量交叉整合，研究力量得到大幅度提高。 在工作保障方面，先后召开了多次全国性家蚕基本研究讨论会，统一了学术结识和研究思路，确立了有机整体方案，形成了有效协作机制。各成员单位均开展了详细前期研究。通过国际学术交流和国际合伙项目，与世界高水平研究机构建立了稳定合伙关系，为本项目开展提供了良好国际合伙空间。此外，通过农业部行业技术体系，建立了国家蚕桑产业技术研发中心和技术研发服务网络，将有力支撑本项目成果转化和应用。咱们相信，通过立项，集成优势，紧密合伙，完全可以在家蚕基本研究上做出更大更出众标志性成果，为丝绸之路增添异彩，为中华民族产业发展做出历史性贡献。5课题设立按总体研究目的和思路，将本项目分解为6个课题进行，详细目的和重要研究内容如下：课题1：蚕丝蛋白合成分子调控与蚕丝品质形成机理解析 研究目：定位克隆与产丝量和丝品质有关重要突变基因，探明家蚕发育主控信号对家蚕前部、中部和后部丝腺发育与细胞功能异化关系，剖析蚕丝蛋白编码基因转录调控网络与调控机制，阐释决定家蚕产丝量和蚕丝重要工艺性状形成分子机理。该课题为项目核心。研究内容： （1）家蚕产丝量和丝品质有关突变基因克隆与功能研究一种新突变基因获得，往往会导致一条控制重要生物性状新机制发现。在长期自然和人为选取过程中，积累了大量家蚕突变品系，关于突变基因遗传研究基本相称夯实。在这些家蚕突变资源中，报道与蚕丝合成有关近30个品系，其中相称一某些都保存至今，弥足贵重。其中，与蚕丝产量有关有5个，涉及薄纸茧（flc，3连锁群-49.0座位（下同），后部丝腺分泌能力低下）、裸蛹（Nd，25-0.0，不分泌丝素）、丝胶茧（Nd-s，14-19.2，丝素轻链不能合成）和裸蛹b（Nd-b，遗传座位未知，丝腺退化）等；与蚕丝品质有关有5个，绵茧（Fl，7-32.1，茧层浮松）和软茧（Sc，遗传座位未知，茧层柔软似绵）等；与蚕茧颜色有关有12个，涉及黄色、绿色、锈色等系列；与蚕营茧行为有关有4个，涉及破风茧和吐平板丝等。上述突变除裸蛹（Nds）基因已被定位克隆（编码基因外显子）外，别的突变基因和机制都不清晰。如能分离克隆这些突变基因，极有也许为家蚕丝蛋白合成研究和分子机制研究打开突破口。 前期项目重点建立了基于SNP标记图位法克隆体系，并已经克隆或者精细定位了5个突变基因，其中涉及与茧丝产量有关裸蛹基因（Nd）和品质有关突变绵茧基因（Fl），均已被锁定到数百K距离，候选基因不超过10个。这两个突变具备重要研究价值：一方面，这两个突变基因座位都与详细编码基因相去甚远，因而不也许是编码基因突变；另一方面，从候选基因状况看，推测与激素和丝腺细胞发育信号有关。因而，本期项目将选某些与产量和质量有关重要突变，配制定位材料，通过高密度SNP标记，精细定位并分离克隆突变基因，重点通过对突变性状产生分子机理研究，寻找家蚕丝蛋白合成调控中信号通路，摸索其与蚕丝产量和品质形成关系。 （2）家蚕丝腺发育调控与丝蛋白编码基因表达空间特异性 家蚕丝腺是来源于外胚层器官，发生在胚子最长期和反转期。丝腺细胞仅在胚胎期发生10次细胞分裂。幼虫期，丝腺细胞不再发生分裂，至5龄后期，一种丝腺细胞核内DNA复制次数达到2930次，细胞核内DNA量增长至107g和214g，分别相称于本来54万倍或108万倍。以满足后期丝蛋白大量合成需要。丝腺细胞分化不但形成了功能特异前、中和后部三个某些，并且决定了丝蛋白编码基因表达空间特异性。项目将研究胚胎期丝腺细胞形成和分化，研究不同丝腺部位分子构造特性与功能关系。丝蛋白编码基因存在着某些核心顺式作用元件，咱们将重点研究丝蛋白编码基因顺势作用元件Pax4、Pax6、FOX类转录因子结合位点功能。挖掘未知转录因子对丝蛋白编码基因转录调控关系，鉴定家蚕丝蛋白编码基因与转录空间特异性有关顺式作用元件，以阐明家蚕丝蛋白合成空间特异性分子机制，并摸索通过转录因子或者顺式作用元件改造，提高丝产量或者变化蚕丝组分也许性。 （3）家蚕丝腺发育调控与丝蛋白编码基因转录时期特异性形成机理 家蚕在孵化之后，就具备合成少量丝蛋白能力。幼虫各个生长龄期后部丝腺都能检测到丝素mRNA转录；但是在眠期却没有丝素mRNA表达，体现为重复“开与关”特性。当幼虫发育到末龄第3天，丝腺开始大量合成丝蛋白，直至幼虫期结束，丝蛋白布满整个丝腺腔体，后来则进入吐丝营茧期，表白家蚕丝蛋白合成具备严格时期特异性。丝纤维三个组要组分，即丝素重链H、丝素轻链L和P25具备严格比例（H:L:P25=6:6:1），这是形成丝素蛋白小体并最后形成丝纤维决定性因素，表白不同丝蛋白编码基因表达量调控具备协调性。 当前为止，已发现了几种丝腺特异因子，如SGF-1和SGF-3，它们参加了丝胶基因及丝素基因转录调控。但其他几种重要转录因子，如SGF-2、SGF-4及PSGF等却尚未鉴定，它们很也许与丝素基因调控有关。前期项目在丝蛋白编码基因上游鉴定了两个与转录因子BR-C Z4和BR-C Z1结合重要位点。BR-C是一种具有BTB蛋白结合构造域及1-4个锌指构造转录因子，具备4种蛋白异构体，它是蜕皮激素重要初级反映基因，并对家蚕蜕皮和变态期基因转录调控起着重要作用。研究还发现，BR-C表达时期与丝蛋白表达时期是相反，很也许与丝蛋白基因上游结合位点序列结合，抑制丝素基因在眠期表达。以此为基本，本期项目将重点研究家蚕丝蛋白重要编码基因上游顺式作用元件与激素信号系统之间互相作用关系，结合本项目课题3，研究激素受体及各下游应答因子对丝蛋白合成调控作用机制，阐明家蚕丝蛋白合成时期特异性和不同丝纤维蛋白组分协同调控性对产丝量影响。 （4）家蚕丝产量和丝品质形成机理普通以为，家蚕产丝能力受各种基因调控并具备伴性遗传特性，而某些茧丝品质具备较高遗传力。本某些研究将产丝量和品质形成机制阐明作为重点，重要涉及三个研究内容： 一方面是定位和克隆产量主性状候选基因。家蚕产丝性状重要涉及茧重、茧层量和茧层率等指标，是长期以来育种工作重要选取对象，虽然有不少提高但机制形成不明。前期项目中，咱们运用高产品种“菁松”和低产品系“兰10”为材料，通过自交，分别得到这两个品系20代以上自交系。然后运用近19万个SNP位点，对该材料进行了全面扫描，初步获得了全茧重、茧层量和丝长等性状明显密切有关QTL位点，而茧层率也具备潜在QTL位点。本期项目将在此基本上，进一步加大样本数量和标记密度，对重要产量性状主效QTL进行精细定位，并克隆分离重要基因或者调控区域，通过度子生物学手段，研究这些基因或者调控序列对家蚕产丝量影响和作用机制。 另一方面是解析蚕丝重要成分蛋白晶体构造。尽管咱们懂得蚕丝纤维由丝素重链H、丝素轻链L和P25蛋白所构成，但是对关于蛋白空间构造和蛋白质-蛋白质互相作用却毫不知情。日本提出了这三种蛋白初步构象关系（丝蛋白小体构造模式），但缺少构造生物学证据。丝纤维构导致为了悬而未决世界难题。前期项目咱们克隆了丝素重链N段序列，并获得了其编码蛋白高辨别率晶体构造，初次发现了其立体构造以片层为主，并初步提出了丝纤维空间构象。以此为基本，本期项目将解析重要成分蛋白，涉及丝素重链H、丝素轻链L和P25晶体构造，不但破解这一世界难题，并且将摸索丝蛋白空间构造与物理、化学特性之间关系，摸索丝蛋白构造与蚕丝加工工艺性状之间关系。以构造生物学为指引，还将摸索变化蚕丝蛋白编码基因或者蛋白质组分，以改进蚕丝工艺缺陷，开发新功能也许路过。 第三是分析影响产丝产量和质量其他重要因素。前期项目中，通过构建不同家蚕品系和野蚕全基因组高精度遗传变异图谱，共计鉴定了354个与产丝性状有关蛋白质编码基因作为驯化候选基因。特别重要是，分析发现了若干与产丝性状有关人工选取印记，其中有4、32和54个基因分别在丝腺、中肠和精巢中高量表达。在丝腺表达基因中，丝腺特异因子-1（Sgf-1）是与果蝇Fkh同源一种基因，Sgf-1调控家蚕丝胶-1基因编码丝胶蛋白和三个分别编码丝素重链、轻链和fhx/P25丝素基因转录。另一种家蚕丝腺高量表达基因是BGIBMGA005127，与果蝇sage基因同源。它在高丝量品种中含量是常规品系“大造”4倍。在果蝇中，Fkh和sage分别协调控制丝胶基因SG1和SG2转录，它们在丝胶蛋白合成和分泌中起着重要作用。本期项目将重点探讨这些候选基因在蚕丝产量和品质形成中重要作用，综合上述各方面研究成果，摸索家蚕较之野蚕产丝能力和丝品质差别重要分子机制。 五年预期目的：（1）丝腺突变基因定位克隆。定位克隆至少9个与丝腺突变有关基因，完毕涉及这些基因在内9个与丝产量和丝品质密切有关调控基因功能研究，解析突变性状产生分子机理，揭示家蚕丝蛋白合成调控中信号通路及其与蚕丝产量和品质形成关系。 （2）阐明家蚕丝蛋白合成时空特异性分子机制。涉及家蚕丝蛋白合成空间特异性和时期特异性分子机制，以及不同丝纤维蛋白组分协同调控性对产丝量影响；获取5个左右核心顺式作用元件，并摸索通过转录因子或顺式作用元件改造，提高丝产量或变化蚕丝组分。 （3）阐明家蚕丝产量和丝品质形成机理。对重要产量性状主效QTL进行精细定位，克隆获得重要基因或者调控区域，探明这些基因或调控序列对家蚕产丝量影响和作用机制；解析丝素重链H、丝素轻链L和P25晶体构造，探明丝蛋白空间构造与物理、化学特性以及与蚕丝加工工艺性状之间关系；分析与产丝性状有关蛋白质编码基因在蚕丝产量和品质形成中重要作用，探明家蚕较之野蚕产丝能力和丝品质差别重要分子机制。总体上阐明决定家蚕产丝量和蚕丝重要工艺性状形成分子机理，摸索通过变化蚕丝蛋白编码基因或蛋白质组分，改进蚕丝工艺缺陷，开发新功能也许路过，为进一步分子育种奠定理论基本。 （4）获得基因专利6项；出版专著1部，在国内外核心刊物刊登论文55篇，其中有重要影响论文10篇以上，刊登1篇有重要理论突破高水平研究论文。 （5）培养和造就一批中青年学术带头人和不同层次科技新人，其中涉及研究生研究生35名、博士研究生15名和博士后2名。经费比例： 17.32% 承担单位： 浙江大学、西南大学、安徽农业大学、中华人民共和国科学技术大学 课题负责人： 钟伯雄 学术骨干： 缪云根、刘春、孟艳、李卫芳课题2：家蚕激素和营养信号传导与变态发育调控研究研究目：重点研究家蚕变态发育昆虫激素信号转导重要途径和核心调控分子作用，揭示激素调控与营养代谢及其与器官退化和再生关系，比较完整地建立关于家蚕变态发育理论体系和机理模型以解释昆虫变态发育这个重大科学问题，增进通过控制变态发育以提高家蚕蚕丝产量和质量技术和方略发展及应用，并为以变态发育有关基因和蛋白为分子靶点进行鳞翅目害虫生物防治和研制新型杀虫剂发展方略提供理论根据与技术指引。研究内容：（1）蜕皮激素和保幼激素协同调控家蚕变态发育分子机制 幼虫蜕皮时，血淋巴中同步有高水平蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）；而在幼虫-蛹变态时，血淋巴中只有高水平蜕皮激素，而保幼激素水平较低。总体而言，蜕皮激素控制着昆虫蜕皮与变态发育进程，而保幼激素控制着昆虫发育方向。因此，蜕皮激素和保幼激素信号传导途径及其分子互作是变态发育核心问题。前期项目已经完毕了家蚕变态发育期基因表达谱全基因组芯片分析，并着重分析了家蚕20E和JH合成代谢途径有关基因，以及20E和JH信号传导途径有关基因功能。已克隆获得激素受体EcR-A、EcR-B和USP-1、USP-2和转录因子HR3、HR39、BR-C-Z4、FTZ-F1、E75A、E75B、E75C等基因，并分析了这些基因在不同步期和组织中表达状况，初步明确了这些基因表达时空特性与20E滴度变化以及与变态发育调控关系。 本期项目将以家蚕丝腺、脂肪体、中肠和表皮为重要研究材料，阐明20E和JH信号传导途径及其分子互作，这两种激素如何协同决定家蚕变态发育。重要内容涉及：1）比较家蚕蜕皮与变态过程基因表达特性，鉴定差别表达基因并探究其与20E或JH应答核心因子作用关系，阐释其在两种不同蜕皮与变态形式中分子作用；2）基于家蚕眠性突变基因品系和家蚕分子标记（SNP或SSR）连锁图谱，通过定位克隆技术，对家蚕眠性突变材料与正常品种回交群体及亲本进行分子标记连锁分析，锁定眠性突变区域，分离克隆眠性突变基因，详细分析其在眠性形成（幼虫蜕皮）中功能；阐明咪唑类激素诱导家蚕眠性变化机制，明晰家蚕眠性变化过程中和二眠化后，20E和JH合成及作用有关基因和蛋白表达谱变化规律；3）基于家蚕化性突变基因品系，分离克隆家蚕化性决定基因，探讨其与20E作用关系及其在化性调节中分子作用机理；4）对家蚕中眠性和化性突变体基因、JH和20E合成途径（如JHAMT）和信号传导途径（如MET）中某些核心基因进行RNAi、基因敲除和转基因研究；5）家蚕JH和20E信号传导和分子互作。发现MET与20E受体形成超级受体复合体，探究MET与EcR-USP蛋白质-蛋白质互相作用，阐释MET如何参加JH和20E信号、如何桥接JH和20E信号传导分子互作；6）JH和20E信号传导途径中核心转录因子基因对家蚕丝腺发育和蚕丝产量调控；7）研究调控蛹期专一表达表皮蛋白基因调控，如JH和20E两个激素信号系统对蛹期专一转录因子BR-C和其上游调控基因met、gce和Kr-h1等调控；研究BR-C转录因子对其下游转录因子POUM2和bFTZ-F1调控作用分子机理；分离和鉴定与转录因子POUM2结合核蛋白，研究其在表皮蛋白基因专一表达调控中作用。 （2）类胰岛素和营养信号传导途径与家蚕个体大小和产丝量关系分子机理昆虫个体大小重要由生长持续时间和生长速度两个因素所决定。蜕皮激素和保幼激素协同调控昆虫变态发育，并决定昆虫生长持续时间。而胰岛素和营养（氨基酸和葡萄糖）信号及其传导途径控制细胞分裂、长大、分化、死亡，并最后决定生长速度。这些激素和营养信号互相作用，最后共同决定个体大小。胰岛素激活Ras-MAPK和PI3K-Akt两条信号传导途径，激活TOR信号；同步，葡萄糖和氨基酸等营养信号提高ATP/AMP比例，解除LKB-AMPK信号对TOR活性抑制作用，最后增进细胞生长和分裂。这样，在激素和营养两方面共同作用下，影响了家蚕个体大小及产丝量。 咱们研究发现，家蚕类胰岛素和营养信号对脂肪体器官重建重要调控作用。类胰岛素信号传导途径中InR和IRS等大多数基因表达水平在蜕皮和化蛹等非摄食时期明显上升。在蜕皮和化蛹时期，20E