DB45_T 2754-2023 芒果品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.docx

ICS 65.020.20 CCS B 0545广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准DB45/T 27542023芒果品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法Code of practice identification of mango varieties by SSR molecular marker method2023 - 08 - 10 发布 2023 - 09 - 30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发 布DB45/T 27542023目 次前言 II1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 缩略语 15 原理 26 材料和试剂 26.1 一般规定 26.2 试剂 26.3 溶液配制 27 仪器和设备 38 SSR 引物序列信息 39 操作步骤 49.1 样品采集 49.2 DNA 提取 49.3 PCR 扩增 49.4 PCR 产物检测 410 数据记录与统计 510.1 数据记录 510.2 统计 511 结果判定 611.1 判定方法 611.2 结果表述 6附录 A（规范性） 引物序列信息 7IDB45/T 27542023前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广西检验检疫标准化技术委员会提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西智标云信息 科技有限公司、广西绿保环境监测有限公司、南宁海关技术中心、广西壮族自治区种子管理站、百色市 检验检测中心、南宁维尔凯生物科技有限公司。本文件主要起草人：赵永锋、莫薇、何京明、杨桂强、罗贵文、梁俊、薛海燕、黄小娟、莫璋红、 刘新彩、郑美玲、黄鹂、李丽、吴妮、官月香、韦东、梁群清、苏丽梅、仝丹丹、刘守廷。IIDB45/T 27542023芒果品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法1 范围本文件界定了芒果品种鉴定技术的相关术语和定义，规定了利用简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记法进行芒果品种鉴定的原理、材料和试剂、仪器设备、引物序列信息、操作步 骤、数据记录和统计、结果判定。本文件适用于广西壮族自治区行政区域内基于SSR分子标记的芒果品种SSR指纹数据采集和品种鉴 定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则3 术语和定义NY/T 2594界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1核心引物 core primer品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合 特性。3.2对照品种 control variety具有所用SSR位点上不同等位变异的特性，用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系 统误差的一类品种。3.3聚合酶链式反应 polymerase chain reaction利用DNA在体外摄氏95 高温时变性会变成单链，低温（经常是60 左右）时引物与单链按碱基互 补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72 左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖 （5'-3'）的方向合成互补链。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。SSR：简单重复序列（Simple Sequence Repeat）。PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction）。 DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid）。1DB45/T 275420235 原理不同品种芒果的基因组成不同，其基因组中SSR的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通过PCR扩 增及电泳技术可以鉴定芒果品种。6 材料和试剂6.1 一般规定除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，水为符合GB/T 6682规定的二级水，其中PCR 用水要求达到一级水指标。6.2 试剂6.2.1 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度99.0。6.2.2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）：纯度99.0。6.2.3 硼酸（H3BO3）： =1.43 g/cm³ , 含量99.5。6.2.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）： =1.32 g/mL，纯度99.0。6.2.5 氯化钠（NaCl）： =2.165 g/cm³ , 含量99.5。6.2.6 琼脂糖。6.2.7 过硫酸铵（ (NH4)2S2O8）： =1.98 g/cm³,含量98.0。6.2.8 氢氧化钠(NaOH）： =2.13 g/cm³ , 含量96.0 。6.2.9 硝酸银（AgNO3）： =4.35 g/cm³ , 含量98.0 。6.2.10 甲醛（HCHO）： =0.815 g/cm³。6.2.11 液氮（N2）： =0.81 g/cm³。6.2.12 三氯甲烷（CHCl3）： =1.50 g/cm³。6.2.13 无水乙醇（CH3CH2OH）： =0.79 g/cm³ , 含量99.7。6.2.14 DNA 分析仪用 LIZ 500分子量内标。6.2.15 去离子甲酰胺（CH3NO）： =1.133 g/mL。6.2.16 40丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acryl/Bis Solution(29:1)）。6.2.17 四甲基乙二胺（TEMED）： =1.32 g/mL。6.2.18 DNA 分子量标准（DNA marker）：可以清楚区分 50 bp500 bp 的 DNA 片段。6.2.19 2×Taq Plus PCR 预混试剂：0.1 U/L Taq Plus Polymerase、500 mol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、稳定剂、增强剂。6.3 溶液配制6.3.1 5×TBE 缓冲液称取5.4 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75 g硼酸（6.1.3） 溶于70 mL一级水中，定容至100 mL，在103.4 kPa（121 ) 条件下灭菌20 min。6.3.2 0.5×TBE 缓冲液量取100 mL浓度5×TBE（6.2.1）缓冲液于烧杯中，加入900 mL一级水混匀。2DB45/T 275420236.3.3 CTAB 提取溶液称取4 g十六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38 g氯化钠（6.1.5）、1.21 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、 1.49 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70 mL一级水，定容至200 mL，在103.4 kPa（121 ) 条件下灭 菌20 min。6.3.4 无菌一级水一级水在103.4 kPa（121 ) 条件下灭菌20 min。6.3.5 1琼脂糖溶液1 g琼脂糖（6.1.6）溶于100 mL 的0.5×TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化。6.3.6 10过硫酸铵溶液称取10 g过硫酸铵（6.1.7），加入100 mL一级水溶解。6.3.7 电泳缓冲液称取108g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55 g硼酸（6.1.3）、 0.8 g氢氧化钠（6.1.8），加入10 L一级水溶解。6.3.8 染色液称取0.2 g硝酸银（6.1.9），加入400 mL一级水溶解。6.3.9 显色液称取4 g氢氧化钠（6.1.8），加入400 mL一级水溶解，临用时再加1.6 mL甲醛（6.1.10）。7 仪器和设备7.1 电子天平：感量为 1 mg。7.2 水浴锅。7.3 高速冷冻离心机。7.4 PCR 扩增仪。7.5 垂直板电泳系统。7.6 凝胶成像系统。7.7 毛细管电泳仪。7.8 胶片观察灯。7.9 涡旋振荡仪。8 SSR 引物序列信息引物序列信息按附录A。3DB45/T 275420239 操作步骤9.1 样品采集随机取5个单株，用不锈钢剪刀采集种植的待测品种芒果嫩叶放入塑料样品袋中，做好标识，放入 0 8 保温箱中，带回实验室，于-18 及以下条件保存。9.2 DNA 提取称取9.1中1 g2 g芒果叶片用自来水冲洗干净，再用一级水冲洗两遍。 自然晾干后用不锈钢剪刀 剪碎放入研钵中，加入液氮（6.1.11）研磨成粉末状。称取100 mg放入1.5 mL离心管中，加入750 µLCTAB 提取溶液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65 水浴45 min60 min，期间每隔15 min颠倒离心管混匀。 加入500 µL的三氯甲烷（6.1.12），颠倒混匀，12000 r/min 离心3 min，转移上清液约0.5 mL至新离心 管中，加入等体积（即0.5 mL）预冷至约4 的无水乙醇（6.1.13），颠倒混匀，-18 下静置1h，12000 r/min 离心3min，弃去上清液，室温下干燥沉淀。加入50 µL无菌一级水（6.2.4）混匀后于-18 及以 下条件保存。注： 以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量的DNA提取方法也适用于本文件。9.3 PCR 扩增9.3.1 PCR 反应体系PCR反应体系参见表1。表1 PCR 反应体系试剂终浓度体积 µL灭菌纯水-8.52×Taq Taq Plus PCR预混试剂1×12.510 µmol/L正向引物0.4 µmol/L1.010 µmol/L反向引物0.4 µmol/L1.025 ng/µL DNA模板2.0 ng/µL2.0总体积 (µL）-25.09.3.2 PCR 反应程序94 预变性5min；94 变性30 s，退火30 s（退火温度按附录A），72 延伸30 s，35个循环；最 后72 下延伸7min。9.4 PCR 产物检测9.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 9.4.1.1 聚丙烯酰胺凝胶制备在一对玻璃板间插入1.0 mm宽的间隔片，在封口处注入1琼脂糖溶液（6.2.5），让其凝固密封。 在50 mL量杯中依次加入7.5 mL 5×TBE缓冲液（6.2.1），7.5 mL 40 Acryl/Bis Solution(29:1)（6.1.16）， 搅拌并用一级水定容至30 mL；加入200 µL 10过硫酸铵（6.2.6）和12 µL四甲基乙二胺溶液（6.1.17），混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50 min60 min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10 cm。4DB45/T 275420239.4.1.2 电泳将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲液（6.2.7），小心拔下样品梳。用加样 器吸取1 µL不同引物（附录A）PCR产物，加入样品孔中，同时在 同一块胶中加入1 µL DNA marker（6.1.18）。 电泳选用的电压梯度为1 V/cm5V/cm，2×Taq Plus 预混试剂（6.1.19）的蓝色指示带从上到下分别 到达胶板1/2处、2/3处（50 min70 min）后结束电泳。9.4.1.3 银染显色银染显色按下列步骤操作。a) 固定：将附着凝胶的玻璃板用去一级水冲洗 30 s60 s 后，将凝胶放入方形不锈钢盘中；b) 染色：加入染色液（6.2.8）覆盖凝胶，轻摇 5 min10 min 进行染色；c) 漂洗：倒掉染色液，用去一级水快速漂洗两次，每次 20 s；d) 染色：放入显色液（6.2.9）中，轻摇至显色出清晰带纹；e) 漂洗：取出凝胶用一级水冲洗两次；f) 沥干后进行拍照。9.4.2 毛细管电泳检测9.4.2.1 PCR 产物样品准备分别量取等体积的稀释后不同引物PCR扩增产物溶液混合，从混合液中吸取1 µL按序号加入到DNA分 析仪专用96孔板孔中，板中各孔分别再加入0.1 µLDNA LIZ 500分子量内标（6.1.14）和8.9 µL去离子甲 酰胺（6.1.15）。将样品在PCR仪上95 变性5 min，取出，迅速置于碎冰块上，冷却10min15min。 将整个96 孔板置于4 000 r/min离心机中，离心10 s后放置到DNA分析仪上待检。9.4.2.2 电泳检测按照仪器操作规程，编辑样品表及运行程序，执行运行程序，仪器自动给出检测结果，保存并记录 数据。10 数据记录与统计10.1 数据记录10.1.1 样品每个 SSR 位点等位变异采用扩增片段长度表示；10.1.2 对于毛细管电泳检测方法，使用对照品种消除 DNA 分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分 析软件读取位点等位变异。10.1.3 对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将待检样品与对照品种的等位变异片段进行比较， 明确待检样品位点等位变异。10.2 统计纯合位点结合等位变异大小数据记为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异大 小数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小，小片段数据在前、大片段数据在后； 缺失位点的等位变异大小数据记录为0/0。示例1：样品在某个位点上仅出现 1 个等位变异，大小为 160 bp，则该位点的等位变异数据记录为 160/160。示例2：样品在某个位点上仅出现 2 个等位变异，大小为 160 bp、165 bp，则该位点的等位变异数据记录为 160/165。5DB45/T 2754202311 结果判定11.1 判定方法11.1.1 当待检样品和对照品种间差异位点数2，判定为“不同品种”。11.1.2 当待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定为“近似品种”。11.1.3 当待检样品和对照品种间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”。11.2 结果表述待测样品 与对照样品 （或数据库中 已知品种）利用 分子标记类型， 采用 检测平台，采用 位点组合进行检测， 结果显示：检测位点数为 ，差异位点 数为 ，判定为（相同或疑同）。6DB45/T 27542023AA附 录 A （规范性）引物序列信息引物序列信息按表A.1。表A.1 引物编号及引物扩增信息序 号引物名称条带大小 bp引物退火温度 引物序列（5-3）1mangoES1114824855正向：CTTCCTTTCTCTCATCACTTCCA反向：CTTCAATAGTAGCCCCATCACTG2mangoES2415727055正向：CAGTAACTACTACCACCGCAACC反向：ATATTCTCGCTCTCGTTGTTTTG3mangoES3515624655正向：TCCATTTTTGACAAATCTCCACT反向：TAGCCTTGAATTCCTCAAACAAA4mangoES3914316355正向：GGTTGTTATCGTCGTTATTGTGG反向：CGGAAAATGTTCGACTTGTAACT5mangoES4014424455正向：GGGACATTGACTTAACAGCTTTC反向：CTTCTGCCTGAATGTACTGGACT6mangoES6915021055正向：CCTGTGCTTACCACCCATATTAG反向：AAAGATTGCAAGTCTGAGCAAAA7mangoES7112518055正向：TGATGAGAATGAACAAGCAGCTA反向：TATCTGCAGTAACAGCACTCAGC8mangoES12614320055正向：CGGGTAAACCCACTATGTATTCC反向：TGGTGGTGGTAAAAAGAAGAAAA9mangoES17015015855正向：TCGAGAGCTACTCTTTATCGGAA反向：AATTAAGCGTGCAAACCTGTAGA10mangoES17214619655正向：TATCATCAGAACTACCGCCATTT反向：CTCTTTTCTTCGCTGTGTTTTGT11EST1417529050正向：ATTATCCCTATAATGCCCTAT反向：CTCGGTTAACCTTTGACTAC12MCR5517022058正向：AGGACATCTGTGACCAAGAGC反向：TTCCCACCCACAACTCCAAC13MCR13025026058正向：TGTCTTTCAGCTTCACCGCT反向：CGCAGTGGAGAGTTGTTGTG14MCR22025051058正向：CGGGACCATGTCACCAGAAA反向：GGCGAATGCGTAGTCAGAGA15Lmma120525550正向：ATGGAGACTAGAATGTACAGAG反向：ATTAAATCTCGTCCACAAGT16Lmma424038047正向：AGATTTAAAGCTCAAGAAAAA反向：AAAGACTAATGTGTTTCCTTC7DB45/T 27542023表A.1 引物编号及引物扩增信息（第2页，共3页）序 号引物名称条带大小 bp引物退火温度 引物序列（5-3）17Lmma528039047正向：AGAATAAGCTGATACTCACAC反向：TAACAAATATCTAATTGACAGG18Lmma610520550正向：ATATCTCAGGCTTCGAATGA反向：TATTAATTTTCACAGACTATGTTCA19Lmma721025050正向：ATTTAACTCTTCAACTTTCAAC反向：AGATTTAGTTTTGATTATGGAG20Lmma826036050正向：CATGGAGTTGTGATACCTAC反向：CAGAGTTAGCCATATAGAGTG21Lmma920523047正向：TTGCAACTGATAACAAATATAG反向：TTCACATGACAGATATACACTT22Lmma1015521050正向：TTCTTTAGACTAAGAGCACATT反向：AGTTACAGATCTTCTCCAATT23Lmma1124041049正向：ATTATTTACCCTACAGAGTGC反向：GTATTATCGGTAATGTCTTCAT24Lmma1221025047正向：AAAGAATAGCATTTAATTAAGGA反向：GTAAGTATCGCTGTTTGTTATT25Lmma1318023047正向：CACAGCTCAATAAACTCTATG反向：CATTATCCCTAATCTAATCATC26Lmma1522027050正向：AACTACTGTGGCTGACATAT反向：CTGATTAACATAATGACCATCT27Lmma1622025050正向：ATAGATTCATATCTTCTTGCAT反向：TATAAATTATCATCTTCACTGC28AY94281812515055正向：CCACGAATATCAACTGCTGCC反向：TCTGACACTGCTCTTCCACC29AY9428199014053正向：AAACGAGGAAACAGAGCAC反向：CAAGTACCTGCTGCAACTAG30AY94282017023053正向：AGGTCTTTTATCTTCGGCCC反向：AAACGAAAAAGCAGCCCA31AY94282128041049正向：TGTAGTCTCTGTTTGCTTC反向：TTCTGTGTCGTCAAACTC32AY94282323055正向：AGAATAAAGGGGACACCAGAC反向：CCATCATCGCCCACTCAG33AY94282422032050正向：TTGATGCAACTTTCTGCC反向：ATGTGATTGTTAGAATGAACTT34AY94282524039053正向：CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC反向：CGAATACCATCCAGCAAAATAC35AY94282624050正向：TGTGAAATGGAAGGTTGAG反向：ACAGCAATCGTTGCATTC8DB45/T 27542023表A.1 引物编号及引物扩增信息（第3页，共3页）序 号引物名称条带大小 bp引物退火温度 引物序列（5-3）36AY94282718024049正向：GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG反向：CTTTCATGTTCATAGATGCAA35AY94282624050正向：TGTGAAATGGAAGGTTGAG反向：ACAGCAATCGTTGCATTC36AY94282718024049正向：GTTTTCATTCTCAAAATGTGTG反向：CTTTCATGTTCATAGATGCAA37AY94282813029053正向：CTCGCATTTCTCGCAGTC反向：TCCCTCCATTTAACCCTCC38AY94282937050050正向：GAACGAGAAATCGGGAAC反向：GCAGCCATTGAATACAGAG9