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    详细柱层析技巧.doc

    • 资源ID:98009203       资源大小:27KB        全文页数:5页
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    详细柱层析技巧.doc

    . 详细柱层析技巧常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 L hAIo  VWhpYkt,  柱子可以分为:加压,常压,减压。 Lrf&g  压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 ,!;qqNk  Gww>3D  减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。ET  加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 fk/L+7  R<s (f)Uc  关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。 En"az  YB9TCv<3bo  柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 ts3#pr  )2a/&L?*!  现在见到的柱子径高比一般在1:510,书中写硅胶量是样品量的3040倍,具体择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.20.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。 S)c$ _              K4W4?;I  关于无水无氧柱,适用于对氧,水敏感,易分解的产品。 E-XO1P  NW,Hs$"u  可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。 CQX<Gbwo  VG "b6&  像我以无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些。 k>Pux:p>  C5x4pB9  听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。 Aida""  KRJSa  关于湿法、干法上样。 cb>V  kuJoIvp  湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。 >VafSf!  1G3!?  很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和,而样品本身又是比较好的固体才会发生,这就应该先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,如果不能重结晶那就不管它了,直接过就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解的。 e(8<  W*$4f=V)p  有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF,DMSO等,会随着溶剂一起显色是一个很长的脱尾),这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1:1,我觉得是越少越好,但是要保证在旋干后,不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样品没有吸附在硅胶上)。 sB43+=m  s92v>hd  溶剂的选择。O  当然是最便宜,最安全,最环保的了。所以大多选用石油醚,乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的,太贵了,除非特别需要不要用不然银子哗哗的,流的比淋洗剂还快,不过因为极性很小,有时还是非它不可。乙醚也可以用,但是就是容易睡觉,注意保持清醒别让溶剂流干了,那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅胶的吸附是一个放热过程,所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷的时候会好一些。甲醇,据说能溶解部分的硅胶,所以产品如果想过元素分析的话要留神,应该经过后继处理,比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少,要依个人的不同需要选择了 3m|I。 v(K%y&n  由于某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛),我们这里是用10升或25升的塑料桶装的,就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质,其他的杂质就可想而知了,所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了,反正下面还有提纯的方法。 ?:NkX3  另外溶剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适,正好极性越来越大了。在过完柱子后,溶剂最后回收要采用常压,因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来,常压时就会减少这种现象,如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。 lIt  WL#p  关于操作问题。 uy/! %B  arXT)ABW  1 装柱。 +z,o:h 5  柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写的都是不能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响,一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,甚至作废! (Rds%    2 加样。 RDsd K  用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的活塞打开,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色的了。 gG  6%K 6%PL$V  加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(24cm就够了),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。 pO8cvg:)L  j eU&/Xut  3 淋洗剂的选择。 (+'ZQ.p  感觉上要使所需点在rf0.20.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开,过柱子就用那种极性,如果rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的状态,可以通过公式的比较:0.6/0.8一次的分离度,肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。 wi,'$2AA  BU%k6pd.  4 样品的收集。 L N; _2  用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 FiITyrv-Y  53)g OZcH  另外,收集的试管大小要以样品量而定,特别是小量样品,如果用大试管,可能一根就收到了三个样品,wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。 M)OUj(  gIHO$1  5 最后的处理。 P=<#5I)  柱分后的产品,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会累积到产品中,所以如果想送分析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗基本了,必要时进行重结晶。 ?1T+<3f  J?7 , g;?  补充 T ncEOR!  OKJXsS.  自然沉降法制备常压色谱柱 m#WmCV  Mhq  常压柱色谱,又称柱层析,是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是,分离效率比经典的化学分离方法高的多,与其他色谱法相比,不需要昂贵的仪器设备,更换流动相和吸附剂方便,消耗材料少,成本低,适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品,因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。 9z4kwp"y5f  UD6dlgp  为了保证色谱柱良好的分离效果,色谱柱应装填得尽可能紧密和均匀,在柱中没有气泡、裂缝或沟槽,也不发生柱的径向或轴向固定相的粒度不均匀分布。传统常压色谱柱的填装分为干法装柱和湿法装柱(也称浆法装柱)两种,这两种方法均存在操作不易掌握、易出现气泡和裂缝,装柱时间长等不足之处。本文提出的新的装柱方法介入干装法和湿装法之间,称之为自然沉降法。 K6x+  o<QR!gR  自然沉降法通过对固定相和溶剂的选择,并辅以新的色谱柱,可对常压色谱柱进行简便、高效的填装。用所述装柱技术制备的色谱柱对多种未知组成样品进行分离1,分离效果明显优于传统装柱法。此外,该法装柱快速,易掌握,不会出现断层和气泡等常见问题,装柱成功率高,具有很好的实际应用价值K,LY  9wuqr.2  1、Flash chromatograph 加压快速过柱 q; 2  快速过柱,避免了扩散的产生,分离效果大大提高。 bbEkd.Mp  2、用薄层层析硅胶装柱,柱层析硅胶干法上样。上样高度不超过2-3mm 5?GS  干法上样,保证了上样的均匀性。 rLGRB9'  3、洗脱剂=展开剂 &yZWtiy-  4、TLC上,二点没有重叠 1bY3Tu  ?3BDa1db  假设: >P6z0M /L  1、柱层析也有一个Rf值。对上面的柱层析技术,该Rf值=薄层层板(TLC)的Rf值。 WwF1  根据我的经验,该假设成立 UR<' |Y  I"1S#-z  问题: OGsE/  设硅胶高度为h厘米,单位厘米的硅胶体积为s。TLC上有两个点,x,y,Rf分别为Rf1和Rf2,其中Rf1>Rf2 "|1kklk&p  现在要把上述两个点分开。请问x什么时候出来,用什么样的接收瓶能保证把两个点分开。 eBa)_(6  l/GbX /M  解答: <0l*NmqXR#  hx=x点出现在柱下方的时候,洗脱剂总共流过的高度 $V4W:+  hy=y点出现在柱下方的时候,洗脱剂总共流过的高度 F"1 I:0v  设硅胶部分含溶剂体积为V,V肯定小于h*s +QO3iJ!ZIr  8*Z x4  当洗脱剂从柱上方流到柱下方的时候,x点到达h*Rf1处,y点到达h*Rf2处。 gf4)Izrc  要让x点到达柱下方,其实就是解下列方程 ?af75Q:0  h/hx=(h*Rf1)/h=Rf1 m B%wY  即:hx=h/Rf1 B!euV+9e2  同理,y点到达柱下方,洗脱剂需流经hy高度,hy=h/Rf2 Wk/qRZ(=  x,y点相差距离为hy-hx,考虑到他们都有扩散,设其扩散半径相同,都为R =U|&o  对于快速柱,扩散效应都不厉害,设其值为,R=(hy-hx)/4,即假设他们中间夹着一个同样大小的中间点 FVJZu M  则x,y点实际相差距离为hy-hx-2R=(hy-hx)/2 4:Rg1  54m8CE$  所以,当接受瓶总共接受到hx*s+V=h/Rf1+V体积的时候,hx开始出现,V<h*s。 HjTqlt  如果接受瓶的体积小于(h/rf2-h/rf1)*s/2的时候,可足够保证分开x和y点, DQ +I  C<E/X!p  举一个例子,如果硅胶高度为h=10cm,单位面积为s=1平方厘米。两点Rf值分别为0.25,0.2 J-Nj,.  则,当接受瓶总共收集到40ml(10*1/0.25)到50ml(10*1/0.25+10*1)的时候,x点会出现。接受瓶容量为(50-40)/2=5ml的时候,可将两点分开。 & FLz8S  "Zv 从上面,可以得出下列推论 hTj|Y;bG  1、如果Rf越小,则点越晚出来,浪费的溶剂越多。 mq;2iW"Sf  2、如果Rf提高,则相应接受瓶的容量应小一些。 1AtxJ  3、Rf合适的高度,应该是在TLC上,两点之间距离刚好可以容纳第三点,这样,理论上就可以分开这两点了。 n&kcT#O  4、上样高度越薄,则其扩散程度越低,分离效果越好。建议高度不超过2-3mm。所以,尽量采用粗柱子 )!|_>K7  5、硅胶高度越长,则浪费的溶剂也越多,不过,接收瓶容量可以更大一些。 0%I  6、硅胶高度越短,接受瓶容量应该小一些。C<4Pk  7、硅胶的高度,比TLC的高度高一些即可,没有必要装的很高。 9+7qp  0 "i&7o  一般为了得到更好的分离,通常是要把样品的Rf值调到0.2-0.3之间,不过,许多情况下,如果接受瓶小一些,即使Rf值在0.5,0.6,也同样可以把紧挨着的点分开,似乎可以验证该文结论。5 / 5

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