第三章--酶的生物合成PPT幻灯片课件.ppt

第三章第三章 酶的生物合成与酶的生物合成与发酵生产发酵生产1 酶的生物合成与发酵生产定义o酶的生物合成：即生物体内酶合成的过程o酶的发酵生产：利用微生物代谢活动生产所需酶的过程 目前工业上使用的酶大多数是利用微生物发酵生产的。2 利用微生物发酵产酶的优点o微生物生长繁殖快，生活周期短，用微生物产酶几乎可以不受限制的扩大生产，满足市场需求o微生物种类多，且在不同环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同底物，这为微生物酶种类的多样性提供了物质基础o微生物培养基来源广泛易得、价格便宜o微生物发酵产酶过程可以采用连续化、自动化控制，生产效率高，经济效益好o可利用分子生物学技术选育菌种，提高酶产率o利用基因工程可使动植物细胞中存在的酶用微生物细胞来生产获得3 工业用部分主要酶的生产菌种微生物类别微生物类别菌名菌名产生的酶产生的酶用途用途细菌细菌枯草杆菌枯草杆菌淀粉酶淀粉酶酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精加工、纺织品脱浆等酒精与啤酒工业、洗涤剂、糊精加工、纺织品脱浆等蛋白酶蛋白酶生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造生丝脱胶、皮革脱毛、胶卷回收、酱油酿造大肠杆菌大肠杆菌L-天冬氨酸酶天冬氨酸酶生产生产L-天冬氨酸：治疗白血病天冬氨酸：治疗白血病青霉素酰化酶青霉素酰化酶制备新青霉素的母核制备新青霉素的母核6-氨基青霉素烷酸氨基青霉素烷酸异型乳酸杆菌异型乳酸杆菌葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶由葡萄糖制果糖由葡萄糖制果糖短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌碱性蛋白酶碱性蛋白酶皮革脱毛皮革脱毛产气气杆菌产气气杆菌异淀粉酶异淀粉酶分解淀粉的分解淀粉的-1,6-糖苷键糖苷键酵母酵母解脂假丝酵母解脂假丝酵母脂肪酶脂肪酶绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品增香绢丝原料脱脂、洗涤剂、医药、乳品增香啤酒酵母、假丝啤酒酵母、假丝酵母酵母转化酶转化酶制造转化糖制造转化糖霉菌霉菌点青酶点青酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡食品加工中食品去氧、除葡萄糖，作试剂测定葡萄糖萄糖放线菌放线菌转化微白色放线转化微白色放线菌菌蛋白酶蛋白酶皮革脱毛皮革脱毛4 酶发酵生产菌种要求o产酶量高，具有生产应用价值o易培养，既能适应大生产粗放的营养和生产条件，包括能利用廉价原料、对工艺条件要求不苛刻o代谢速率高，发酵周期短o产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不易感染噬菌体o安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢物安全无毒，在系统发育上与病原体无关o选用产胞外酶菌种，有利于酶的分离提取5 微生物产酶菌株的获得o含菌样品采集o菌种分离纯化o菌种的初筛o菌种的复筛o最佳产酶条件初步确定o微生物产酶性能的进一步提高o微生物产酶菌种保存6 酶发酵工艺条件及控制o培养基营养成分：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂等o发酵条件控制剂对产酶的影响：温度、pH值、溶解氧o固定化微生物细胞发酵产酶的工艺及其控制7 培养基成分o碳源：是构成菌体细胞的主要元素、构成酶骨架的元素之一，也是菌体生命活动所需能量的主要来源。应根据细胞对酶营养要求的不同而选择合适碳源o氮源：是生物体合成各种含氮物质的组成成分，是酶制剂生产的原料o无机盐：大量元素和微量元素o生长因子：氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶、激素等。o产酶促进剂：诱导物和表面活性剂8 发酵条件控制及对产酶的影响o温度：影响微生物生长和合成酶、影响酶合成后的稳定性opH:影响微生物体内各种酶活性，从而导致微生物代谢途径发生变化；影响微生物形态和细胞膜通的透性，从而影响微生物对培养基中营养成分的吸收以及代谢产物的分泌；影响培养基中某些营养物质的分解或中间产物的解离，从而影响微生物对这些营养物质的利用 9 生产中pH调控方法o调节培养基初始pH值，控制合适C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之比例；o补料调节，即通过发酵过程中流加碳源、氮源来调节pH；o添加缓冲液，维持一定pH值；o如pH值变化较大，可直接流加酸或碱进行调节；o通过对溶解氧的调节，来控制中间产物的氧化程度。10 发酵条件控制及对产酶的影响（二）o溶解氧：通气量越大、氧分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。此外，培养液的性质，主要是粘度、气泡以及温度等对溶氧速率有明显的影响，可通过以上方面调节溶氧速率。溶氧量过低，会对微生物生长、繁殖和新陈代谢产生影响，从而使酶产量降低。但，过高的溶氧量对酶的发酵生产业会产生不利影响，一方面会造成浪费，另一方面高溶氧也会抑制某些酶的生物合成，因此在整个发酵过程中应根据需要控制好溶氧量。11 固定化微生物细胞产酶的工艺条件及其控制应注意事项o需要对固定化微生物细胞进行预培养o增加溶宜解氧的供给o发酵温度的控制o培养基组分的特殊要求：1）培养基浓度不过高，并可通过改变培养基组分来降低培养基粘度，有利于氧的溶解和传递，从而克服固定化细胞好氧发酵过程中氧溶解和传递的限制；2）培养基组分不能影响固定化细胞的结构稳定性，或影响很小12 固定化微生物原生质体发酵产酶的工艺条件及其控制应注意事项o培养基渗透压的控制o控制培养基组分，防止细胞壁再生o维持较高的原生质体浓度13 提高酶产率的方法o酶生物合成的调控机制o打破酶合成调节机制及提高酶产量的方法14 酶生物合成的调控机制o酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度，细胞根据其自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控o酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节，在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中，转录水平的调控占主导地位，是酶生物合成中最重要的调节15 操纵子o操纵子（operon）是一组功能上相关且受同一调控区控制的基因组成的遗传单位o操纵子是酶合成调控的结构基础16 操纵子调控模型n根据基因调节理论，在 DNA 分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有 4 种。它们是调节基因（regulator gene）、启动基因（promoter gene）、操纵基因（operator gene）和结构基因（structural gene）。1.结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。2.操纵基因可以与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。17 操纵子调控模型（二）3.启动基因决定酶的合成能否开始，启动基因由两个位点组成：一个是 RNA 聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cyclic AM P，cAM P）与 CAP 组成的复合物（cAM P-CAP）的结合位点。CAP 是指环腺苷酸受体蛋白（cAM P acceptor protein）或分解代谢物活化剂蛋白（catabolite activator protein）。只有到达启动基因的位点时，RNA 聚合酶才能结合到其在启动基因上的相应位点上，转录才有可能开始，否则酶就无法开始合成。18 阻遏蛋白n调节基因可以产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。n当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNA 聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进入到结构基因的位置进行转录，因而无法将 DNA 上的遗传信息转录到 mRNA 分子上，酶的生物合成也就无法进行。n只有当阻遏蛋白通过与效应物（又称辅助阻遏物）结合，改变结构而不与操纵基因结合时，RNA 聚合酶才能结合到启动基因的位点上，进行转录，使结构基因所对应的酶进行生物合成。19 原核生物操纵子类型o诱导型操纵子（inducible operon）：在无诱导物时，其基因不表达或表达的水平很低，只有当诱导物存在时，才能进行转录生成mRNA，进而经翻译合成酶。如乳糖操纵子o阻遏型操纵子（repressible operon）：在无阻遏物时，基因正常表达，当有阻遏物时，转录则受到阻遏，酶不能合成。如色氨酸操纵子20 转录水平的调节o酶生物合成的诱导作用o酶生物合成的反馈阻遏作用o分解代谢物阻遏作用21 酶o根据酶生成是否与环境中所存在的该酶底物或其相关物质的关系，把酶分为：1 组成酶：是细胞内固有的酶类，不管是否其底物或结构类似物存在都有一定量存在，它的合成是在相应的基因控制下进行的，如EMP途径中的酶类2 诱导酶：是细胞为适应外来底物或结构类似物时而合成的一类酶，其合成明显受环境因素影响22 酶合成的诱导现象o大肠杆菌在葡萄糖培养基上不能产生利用乳糖的酶o当培养基中只有乳糖时，可产生利用乳糖的酶o在培养基中添加葡萄糖后，利用乳糖的酶消失23 乳糖操纵子诱导酶合成的过程R：调节基因O：操纵基因S：结构基因24 酶生物合成的诱导作用o酶合成的诱导作用：由于加入某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用o诱导物：能诱导酶合成的物质，称为诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶o诱导物一般是酶催化作用的底物、酶底物类似物或酶催化反应的产物。例如，-半乳糖苷酶的作用底物乳糖及其底物类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导-半乳糖苷酶的生物合成；蔗糖及蔗糖甘油单棕榈酸酯诱导蔗糖酶的生物合成等。有些酶也可由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它也可以作为诱导剂，诱导果胶酶的产生；纤维二糖作为纤维素酶的催化反应产物可诱导纤维素酶的生物合成等。25 酶合成阻遏现象o大肠杆菌在无机盐和葡萄糖培养基中可检测到色氨酸合成酶，可满足自身需要；o若在培养基中添加色氨酸，可发现色氨酸合成酶的活性降低，甚至消失，色氨酸不再合成；o色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则，即不需要，不合成。26 分解代谢物阻遏作用p分解代谢物阻遏作用是指某些物质（主要是指容易利用的碳源）经过分解代谢产生的分解代谢物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。例如，葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成，果糖阻遏-淀粉酶的生物合成等。p分解代谢物阻遏作用之所以产生，是由于某些物质（如葡萄糖等）经过分解代谢放出能量，有一部分能量储存在 ATP 中。ATP 是由 AMP 和 ADP 通过磷酸化作用生成的。这样细胞内 ATP 的浓度增加，使 AMP 的浓度降低，存在于细胞内的 cAMP 就通过磷酸二酯酶的作用水解生成 AMP。27 酶生物合成的反馈作用o酶生物合成阻遏物的反馈作用又称产物阻遏作用，是指酶催化的产物或代谢物的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象，它是通过阻止编码该酶的基因的表达而进行的。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物或叫共阻遏物。被辅作用而停止合成的酶叫阻遏酶o共阻遏物一般是酶催化反应的产物或是代谢途径的末端产物。例如，无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物，它的过量存在，却会阻遏碱性磷酸酶的生物合成；色氨酸作为色氨酸合成途径的终产物，它的过量积累却反过来对其合成途径中的 4种酶（邻氨基苯甲酸合成酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸转移酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶和色氨酸合成酶）的生物合成均起反馈阻遏作用28 酶生物合成阻遏作用的调节机制o在没有共阻遏物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合。所以，RNA 聚合酶可以结合到其在启动基因的位点上，进行转录，而合成结构基因所对应的酶o而当环境中有辅阻遏物，并达到一定浓度时，阻遏蛋白与辅阻遏物结合，使阻遏蛋白结构发生变化，从而使阻遏蛋白与操纵基因结合。RNA聚合酶就不能通过操纵基因而移动到结构基因进行转录，因而阻遏了酶的生物合成29 分解代谢物阻遏作用o某些物质（主要指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（特别是参与分解代谢的酶）生物合成的现象称为分解代谢物阻遏作用，也称葡萄糖效应o分解代谢物阻遏作用之所以产生，一是由于葡萄糖等的分解代谢引起ATP浓度上升，消耗胞内cAMP；二是当葡萄糖等作为唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶活性有抑制作用，降低cAMP的生成30 机制o葡萄糖等易利用碳源经过分解代谢放出能量有一部分储存在 ATP 中。ATP 是由 AMP 和 ADP 通过磷酸化作用生成的。这样细胞内 ATP 的浓度增加，使 AMP 的浓度降低，存在于细胞内的 cAMP 就通过磷酸二酯酶的作用水解生成 AMP。cAMP的浓度降低，cAMP-CAP复合物减少，RNA聚合酶也就无法结合到其启动基因的相应位点上，故转录不能进行，酶的生物合成受到阻遏o随着细胞的生长和新陈代谢的不断进行，ATP被消耗而浓度降低，细胞内ADP及AMP浓度增加，cAMP的生成增加，当cAMP浓度增加到一定水平时，cAMP-CAP复合物结合到启动基因的特定位点上，RNA聚合酶也随之结合到相应的位点上，酶的生物合成才可能进行（但诱导酶还同时需诱导物存在）31 打破酶合成调节机制限制，提高酶产量o通过条件控制（包括添加诱导物和降低阻遏物浓度）提高酶产量o通过基因突变和基因重组提高酶产量o其他方法32 通过条件控制提高酶产量o添加诱导物：只适宜诱导酶的合成，其关键在于选择的诱导物及浓度。诱导物包括：1）酶的作用底物；2）一些难代谢的底物类似物；3）酶催化产物；4）诱导物前体物质o降低阻遏物浓度：阻遏作用有产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏是由酶催化作用的产物或者代谢途径末端产物引起的阻遏作用，而分解代谢物阻遏作用则是由葡萄糖和其他容易利用的碳源等物质经分解代谢而产生的物质引起的阻遏作用33 减少或解除分解代谢物阻遏作用措施o尽量不用葡萄糖等容易被利用碳源，而采用其他较难利用的碳源o采取补料流加以及分次流加碳源的方法，将碳源的浓度控制在较低水平，避免阻遏现下发生，以利于提高酶产量o在分解代谢物阻遏存在下，添加一定量的cAMP，可以解除或减少分解代谢物阻遏作用，若同时有诱导物存在，即可迅速提高酶产量34 解除产物阻遏作用措施o在培养基中添加尾产物类似物，避免尾产物大量生成o采用尾产物的营养缺陷型菌株发酵产酶，通过外加该营养物质，人为控制其营养物质处于亚适量状态o直接去除尾产物o在培养基中添加阻止尾产物形成的抑制剂，以减少阻遏物积累35 通过基因突变和基因重组提高酶产量途径o使诱导型菌株变成组成型菌株，即获得的突变株不管诱导物是否存在，酶都能正常合成，这种菌体称为组成型突变体o使阻遏型菌株变成去阻遏型菌株（抗阻遏菌株），即获得的突变株在有阻遏的条件下，酶产量达到无阻遏的水平。也可通过基因工程等手段增加细胞内基因拷贝数，提高酶产量36 其他方法提高酶产量o添加表面活性剂：表明活性剂能提高细胞膜透性，利于胞外酶的分泌，有助于打破细胞内酶合成的“反馈平衡”，提高酶产量o添加其他产酶促进剂37 3.4 酶发酵动力学o是研究发酵过程中速率及其影响科学的因素，包括：细胞生长动力学反应基质消耗动力学酶生成动力学。o通过这些研究来了解酶的生物合成模式，优化控制发酵工艺条件，从而提高酶产量。38 数学模型建立o细胞生长、繁殖和代谢是一个复杂的生物化学过程，细胞培养体系具有多相、多组分、非线性的特点。因此，要对细胞体系进行动力学模型研究，首先要对细胞培养体系进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推导出数学模型。39 细胞体系的均衡生长模型o是在进行细胞体系的动力学研究时，把细胞在培养液中的生长视为均衡生长，也即是对细胞群体的动力学行为的描述，不考虑细胞之间的差别，把菌体视为单组分，细胞内各种成分均以相同的比例增加，并在此基础上来进行动力学研究。40 3.4.1 酶生物合成的模式o细胞在一定条件下分批培养，其生长过程一般经历四个时期：调整期、生长期、平衡期和衰颓期。o根据酶生产与细胞生长的关系，把酶的生物合成分成四种类型：同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型。41 1）同步合成型o酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式，该类型酶的生物合成与细胞生长存在密切联系，所以又称生长耦联型。o特点：酶的生物合成是伴随细胞的生长而开始的，在细胞进入旺盛生长期时，酶大量合成，当细胞进入平衡期后，酶的合成随之停止。o大部分组成酶的生物合成属于同步合成型。o酶生物合成调节特点：酶的生物合成可以诱导，但是不受分解代谢物的阻遏作用和产物的反馈阻遏作用。o该类型所对应的mRNA很不稳定，其寿命仅有几十分钟，在细胞进入生长平衡期后，新的mRNA不再合成，原有mRNA很快被降解，酶的生物合成停止。42 2）延续合成型o特点：酶的生物合成伴随细胞的生长而开始，但当细胞生长进入稳定期后，酶仍可以继续合成一段较长时间。属于该合成类型的酶可以是组成型，也可是诱导型o调节特点：其生物合成可以受诱导物的诱导，但一般不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。o该类型mRNA稳定，在平衡期后的相当一段时间仍可通过翻译合成对应的酶。当延续合成型酶的生物合成受分解代谢物阻遏时，在培养基中若没有阻遏物，则呈现延续合成型，而在培养基中存在阻遏物时，便成为滞后合成型。43 3）中期合成型o是同步合成型的一种特殊形式，其酶合成特点：在细胞生长一段时间后酶才开始合成，而在细胞生长进入稳定期后，酶的生物合成也随之停止。o代谢调节特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用omRNA稳定性差，其寿命短，在细胞进入生长平衡期后，新mRNA不再生成，原有mRNA很快降解，酶的生物合成随之停止44 4）滞后合成型o特点：在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称非生长耦联型。o酶的代谢调节特点：酶的合成受分解代谢物阻遏用作。其mRNA稳定性很好。o酶的生物合成模型不是一成不变的，酶所对应的mRNA稳定性、培养基中诱导物的存在以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。45 各类型的比较（一）o最理想的合成模式是延续合成型，因为属于延续合成型的酶在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别，酶合成时间比较长，可以明显提高产酶率和缩短发酵周期。可通过以下措施改变其合成模型，使其成为或接近延续合成型。o具体措施：1）通过菌种选育，提高mRNA稳定性，解除分解代谢物阻遏和反馈阻遏，从而得到理想的酶合成模式的优良菌株；2）工艺参数的优化控制：降低产酶温度，提高mRNA稳定性，延长产酶的持续时间；3）发酵代谢调节：添加理想诱导物、解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏如难利用碳源的使用以及补料发酵等。46 各类型的比较（二）o同步合成型：尽量提高其对应mRNA稳定性，适当降低发酵温度。对于有诱导作用的酶的合成，添加理想诱导物，让酶合成及时开始。o滞后合成型：降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶生物合成提早开始。o中期合成型：一方面要采取措施提高mRNA稳定性，延迟其生物合成停止时间，另一方面要解除阻遏，使其生物合成的开始时间提前。47 3.4.2 酶生产过程中的细胞生长动力学o细胞生长动力学是研究细胞生长速度以及环境因素对细胞生长速度影响的规律。rx为细胞生长速率X为细胞浓度为比生长速率o当培养物中只有一种限制性基质，而不存在其他限制生长的因素时，为此限制性基质浓度的函数，这就是莫诺德生长动力学模型。S为限制性基质浓度m为最大比生长速率Ks为莫诺德常数48 参数意义om是指限制性底物浓度过量时的比生长速率，即当SKs的时候，m；oKs是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度，即0.5m的时候，S Ks。om和Ks是微生物在某种特点条件下的特征常数，不同的微生物有其不同的m和Ks值。一般，m变化不大，而Ks则较大变化。事实上，Ks大小的意义表示了菌体对基质的亲和力大小。Ks越大，说明菌体对基质的亲和力越弱，即对基质浓度越不敏感。相反，Ks越小，说明菌体对基质的亲和力越大，即对基质浓度越敏感。49 游离细胞连续全混流生物培养的生长动力学方程D为稀释率，是指单位时间内流加的培养液与发酵容器中培养液体积之比，单位h1。50 参数意义oD，dX/dt为负值，培养液中的细胞浓度不断被稀释而逐渐降低，随着细胞浓度的降低，限制性基质浓度相对升高，使增大，在等于D时，重新建立新的平衡，达到稳态。oDm，细胞浓度趋向于0，无法建立稳态。莫诺德方程最大比生长速率m和莫诺德系数Ks可由双倒数作图法求出。51 3.4.3 产酶动力学o产酶动力学主要是研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。o研究范围：1）研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，称为宏观产酶动力学或非结构动力学；2）研究细胞中的酶合成速率及其影响因素，称为微观产酶动力学或结构动力学。o宏观产酶动力学研究相对更具实际意义，宏观产酶动力学与细胞比生长速率和细胞浓度以及细胞产酶模式有关。它真正反映细胞群体在发酵生产中的产量的高低。52 产酶动力学方程53 不同产酶模式产酶动力学方程o根据细胞的产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学的关系也有所不同。n同步合成型：n中期合成型的酶，为特殊的生长偶联型，其产酶动力学方程与同步合成型相同，然而，在有阻遏物存在时，0，无酶产生，在解除阻遏后，才开始酶的合成。n滞后合成型的酶，为非生长偶联型，生长偶联型的比产酶速率。0，其产酶动力学方程可表达为：n延续合成型的酶，在细胞生长期和平衡期均可产生酶，是部分生长偶联型，其产酶动力学方程为：54 非生长耦联型产酶注意要点o应充分注意菌体在生长期和产酶期的营养要求的差别。可适当配用快速利用和缓慢利用的营养物比例，以分别满足不同时期菌体细胞的不同需要。快速利用的碳源在细胞生长时期消耗，而缓慢利用的碳源用来供产物合成时期使用。这样可以使得菌体的衰老自溶现象延迟出现，延长产物合成期，提高产物产量。55 3.4.4固定化细胞生长特点o固定化细胞在适宜的条件下培养时，固定在载体上的细胞以一定的速率生长，在达到平衡期以后的相当长的一段时间内，固定化细胞的浓度基本上保持恒定。同时，随着固定化细胞的生长和增殖，有一些细胞泄漏到培养液中，这些泄漏细胞如同游离细胞一样，在培养液中生长繁殖。56 固定化细胞生长动力学o在固定化细胞的培养系统中，细胞包括固定在载体的细胞和游离细胞两部分。即：式中，下标g和f分别代表固定在载体上的细胞和游离细胞。57 式中，mg、mf分别代表固定在载体上的细胞和游离细胞的最大比生长速率。Ksg、Ksf分别代表固定在载体上的细胞和游离细胞的莫诺德常数。58 固定化细胞产酶动力学o在固定化细胞发酵过程中，固定在载体上的细胞和培养液中的游离细胞都可产生酶。即：59 固定化细胞连续产酶动力学o对于固定化细胞全混流连续培养，只有反应器中游离细胞浓度Xf随稀释率D而变化，而固定化细胞浓度Xg不随稀释率D变化。当达到稳态时，其细胞生长速率可表述为：o由于在培养液中游离细胞是少量的，所以固定化细胞可在高稀释率的条件下连续发酵，对总体细胞浓度和产酶量影响不大。60 3.5 动植物细胞培养特性61 动植物细胞与微生物细胞差别o动植物细胞比微生物细胞大得多o动植物细胞对剪切力敏感o动植物细胞生长速率与代谢速率低，生长和倍增时间周期长o动植物细胞对营养要求比微生物细胞和植物细胞复杂o生产的主要产物不同o存在缺点：1）动植物细胞对剪切力敏感，要求特殊的反应器和培养方法；2）动植物细胞对防止杂菌污染的技术要求高；3）营养要求苛刻。62 植物细胞培养产酶（一）o植物是各种色素、香精、药物和酶等天然产物的主要来源。至今为止，植物来源的天然物质的生产几乎都是采用提取法。即首先收集植物(栽培的或野生的)，然后来用各种生化技术，把有用的物质从植物组织细胞中提取分离出来。o植物细胞发酵技术首先从植物组织中选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得高产、稳定的植物细胞。然后，用植物细胞在人工控制条件的植物细胞反应器中，如同微生物细胞那样，进行发酵而获得各种所需的产物。63 植物细胞培养产酶（二）o植物细胞发酵生产天然产物与从植物中提取分离这些物质相比较，具有如下特点：1提高产率 使用高产稳定的植物细胞进行发酵，可明显提高天然产物的产率。2缩短周期3易于管理，减轻劳动强度4提高产品质量n然而，植物细胞与微生物相比，存在对剪切力敏感和发酵周期长的缺点，由此引起的一系列问题有待研究解决。64 植物细胞发酵产酶工艺条件控制o选择高产培养材料o光照o培养基组分及浓度o温度和pH值o通风与搅拌（溶氧的影响）o诱导物或前体的添加o刺激剂的应用65 动物细胞培养产酶o动物细胞可以产生各种有较高价值的物质。特别是激素、疫苗、单克隆抗体和酶等各种动物功能蛋白质，通过动物细胞培养和发酵得到的动物功能蛋白主要有如下几种：1.疫苗：脊髓灰质炎(小儿麻痹症)疫苗，牲畜口蹄疫疫苗，风疹疫苗，麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，黄热病疫苗，狂犬病疫苗，肝炎疫苗等。2.激素：催乳激素，生长激素，前列腺素，促性腺激素，淋巴细胞活素，白细胞间质素，干扰素，胰岛素等。3.酶：胶原酶，血纤维蛋白溶酶原活性剂等。4.单克隆抗体：通过杂交瘤细胞等动物细胞培养生产各种单克隆抗体。66 动物细胞培养方式o悬浮培养o贴壁悬浮细胞培养o固定化细胞培养67 动物细胞发酵产酶工艺条件控制o动物细胞培养基组分：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等o温度控制opH控制o渗透压控制o溶氧控制68 本章结束，祝学习愉快！本章结束，祝学习愉快！69