抗体工程要点.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,抗体工程,1,抗原的来源,生物组织纯化,蛋白的纯化方法：,1.,离子交换,2.,凝胶过滤,3.,亲和层析,4.,输水作用层析,等。,2,2024/8/29,抗原的来源,人工合成（化学方法）,1.,半抗原的合成,2.,抗原多肽的合成：多肽合成仪,3,2024/8/29,抗原的来源,蛋白的重组表达,1.,原核细胞的表达方法：大肠杆菌，枯草杆菌。,2.,酵母细胞的真核表达方法：甲醇毕赤酵母的重组表达。,3.,昆虫细胞的表达：杆状病毒表达载体。,4.,哺乳动物细胞的表达：,CHO,，,HEK293,。,5.,抗原的单独表达和融合表达。,6.,表达标签（,TAG,）：,Fc,标签，,HIS,标签，,FLAG,标签（,DYKDDDDK,），,C-MYC,标签，,GST,标签等。,4,2024/8/29,原核表达系统,质粒：,1.,多克隆位点（,MCS,）,2.,抗性基因,3.,启动子（,P,）,4.,复制起始位点（,Ori,）,5,2024/8/29,原核细胞的表达,操纵子表达模型与启动子：,6,2024/8/29,酵母真核细胞表达系统,酵母表达系统的优缺点：,操作简便。,表达量高。,培养条件简单。,易于纯化。,N-,端可能会有氨基酸缺失。,存在过量糖基化的可能。,7,2024/8/29,昆虫杆状病毒表达系统,8,2024/8/29,哺乳动物细胞表达系统,稳定表达细胞系：,CHO,细胞,瞬时表达细胞系：,293,细胞,载体：,原核载体骨架,真核启动子,增强子,多克隆位点,PolyA,信号,真核细胞筛选标志,加压筛选基因,9,2024/8/29,哺乳动物细胞表达系统的特点,可以分泌表达，活性高。,纯化步骤可能比较复杂。,糖基化比较正常。,成本较高，表达量偏低。,周期较长。,可以建立无血清培养的方法。,10,2024/8/29,第三章 抗体分子的结构和分类,CDR,区：互补决定区,FR,区：框架区,重链分子量：,450-550,个氨基酸残基构成，,45-70kd,轻链分子量：大约,214,个氨基酸残基构成，,22-24kd,11,2024/8/29,抗体分子片段,12,2024/8/29,抗体分子的分类,IgA,和,IgM,的,J,链，,IgA,的分泌片,IgG,：,1,2,3,4.,13,2024/8/29,bacteria,Ab+antigen aggregates are ingested by phagocytic cells,viruses,They can recognize:,Cancer,cells,Proteins,carbohydrates,small molecules,etc,etc.,Antibodies tend to aggregate their targets,(viruses,cells),(proteins),What can antibodies do?,Xenotransplantation,Autoimmuno diseases,14,2024/8/29,特殊的抗体分子,卵黄抗体,IgY,：由两条重链（,H,）和轻链（,L,）组成，重链（,）由一个可变区（,V,）和,4,个恒定区（,C,）组成，没有铰链结构。完整分子量为,180KDa,（,7.8S,），重链为,67,70KDa,，轻链为,25KDa,，但还存在一个小体积副本，,120KDa,（,5.7S,），发现于野鸭和某些龟类中。克隆,IgY H,链表明，较小的,IgY H,链缺乏,C3,、,C4,区，称为,IgY,（,Fc,）,15,2024/8/29,单域抗体,特点：,1.,见于驼类动物，软骨鱼类,2.,没有轻链多肽。,3.CDR3,区较长。,4.,驼类单域抗体没有,CH1.,5.,去除,Fc,片段后称为纳米抗体。,16,2024/8/29,抗体的生物学功能,特异性的结合抗原,激活补体,结合,Fc,受体,1,）调理吞噬作用：巨噬细胞。,2,）介导过敏反应：肥大细胞。,3,）,ADCC,作用：,NK,细胞、单核细胞。,4,）穿过胎盘和粘膜,5,）免疫调节。,17,2024/8/29,抗体的来源,抗体的定义,抗体的发现：,1888,年,Emile Roux,和,Alexander Yersin,发现了白喉毒素，,1890,年,Von Behring,发现，白喉毒素或者破伤风毒素免疫动物后，血液中可以产生阻止毒素诱发疾病的物质，称为抗毒素（,antitoxin),。,电泳分析,gamma,球蛋白（并不全是抗体）,1972,年世界卫生组织和国际免疫学联合会把具有抗体活性及化学结构与抗体类似的一类球蛋白，统一命名为免疫球蛋白（,immunoglobulin),。,18,2024/8/29,人血清球蛋白的电泳图谱,白蛋白,a1 a2 b g,白蛋白,a1,a2,b,g,19,2024/8/29,抗体生成的理论,1897,年，,Paul Ehrlich,提出了侧链学说，他认为细胞表面有特异性受体分子，可以释放的血液里面，就是抗毒素（抗体）。,1930,年，,Breinl,和,Haurowitz,提出模板学说，认为抗原是抗体合成的模板。,1955,年，,Jerne,提出天然抗体选择学说，抗原抗体的复合物刺激细胞产生更多针对该抗原的抗体。,1958,年，,Macfarlane,，,Burnet,，,David Talmadge,和,Joshua,提出了克隆选择学说，每一个产生抗体的细胞克隆（,B,细胞）只能产生一种抗体，抗原与,B,细胞表面的膜型抗体分子结合，刺激,B,细胞的增殖分化，浆细胞，生产更多的抗体。,20,2024/8/29,Clonal selection theory,细胞凋亡（,apoptosis,：,Caspase,）,细胞自噬（,autophagy,：溶酶体）,21,2024/8/29,人体内可以产生,10E,12,以上不同的抗体分子，为什么？,22,第四章 抗体的基因及其表达,抗体重链基因簇（,IgH):14,号染色体，,1.5Mb,抗体轻链,Kappa,基因簇（,IgK,）：,2,号染色体，,800kb,。,抗体轻链,Lamda,基因簇（,IgL,）：,22,号染色体，,700kb),。,23,2024/8/29,抗体重链的基因及其表达,V,基因：,51,个,J,基因：,6,个,D,基因：,27,个,C,基因：,10,个,RNA alternative splicing,24,2024/8/29,轻链的基因与重排,V,基因：,30,个,J,基因：,4,个,C,基因：,4,个,V,基因：,40,个,J,基因：,5,个,C,基因：,1,个,25,2024/8/29,抗体基因重排的机制,RSS,：,rearrangement signal sequence,重排信号序列,12/23,规则,RAG:recombination activating gene RAG1,和,RAG2,异源二聚体,TdT,：,terminal deoxynucleotidyl transferase,末端脱氧核苷酸转移酶,26,2024/8/29,抗体类别的转换,S,区介导的二次重排：,switching region,，除了,C,d,外，其它,C,基因前都有,S,区序列。,27,2024/8/29,抗体多样性的原因,多种不同的基因片段。,不同重链和轻链的随机取用和组合。,VDJ,基因片段重组时连接的多样性，连接区的核苷酸插入。,体细胞的高突变频率。,28,2024/8/29,抗原与抗体的相互作用,6,个,CDR,区，非共价结合抗原，空间可变结构的结合。,作用特点：,特异性,可逆性,有量效关系。,29,2024/8/29,抗体的制备,多克隆抗体：抗血清,血清与血浆,抗体的滴度,单克隆抗体：由单一细胞克隆分泌的，识别同一个抗原决定簇，结构与功能都完全相同的抗体。,基因工程抗体：通过基因工程方法生产或者改造过的抗体分子，一般采用工程细胞进行表达。,30,2024/8/29,免疫血清的制备方法,免疫血清的要求：效价高，特异性强。,抗原的纯度,免疫佐剂,抗原的分类：颗粒型，可溶胶体。,抗原和半抗原：,40kd,半抗原,6000,以下。,抗原的纯化方法：层析，电泳。,31,2024/8/29,半抗原与载体蛋白的偶联,常用的载体蛋白：,BSA,，,OVA,，,KLH,偶联机制：,1,）形成酰胺键,2,）氨基间形成连接桥（,NH-R-NH,）,3,）形成偶氮键（,-N=N-,）：如酪氨酰、组氨酰、赖氨酰残基间。,4,）对于没有羰基和氨基的半抗原，引入连接基（,spacer,），再与蛋白偶联，甲醛等。,32,2024/8/29,佐剂的使用,氢氧化铝佐剂（适合人用疫苗）,明矾佐剂,石蜡油、羊毛脂等。,抗原的乳化方法：,1,）研磨法,2,）注射器乳化法,3,）超声乳化,4,）复合乳剂：增加,2%,的,Tween-20,生理盐水，机械或者超声乳化。,33,2024/8/29,动物的免疫,需要考虑动物种系、抗原剂量、免疫途径、加强免疫的时间、免疫次数和佐剂的使用。,用于免疫的动物：兔、大鼠、小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、鸡、山羊、马、驴、猴等。,1,）抗原与动物种属的关系,2,）动物的生理状态,3,）血清的用量,抗原的用量：兔,0.5-1mg/kg,体重。小鼠：,10-100ug,。,免疫途径：静脉,=,脾脏,=,淋巴结,腹腔,肌肉,皮下,皮内。,加强免疫（,boost,）：每隔,2-3,周免疫,1,次，,2-3,次后，,1,周后检测血清中的抗体滴度，然后可以放血，制备抗体。,免疫方案：皮下多点注射。第,1,次福氏完全佐剂，后面福氏不完全佐剂。,34,2024/8/29,福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分,成分 完全佐剂 不完全佐剂,石蜡油,6,份,+,无水羊毛脂,4,份,+,杀死的分枝杆菌,3-5 mg+-,磷酸缓冲溶液,10,份,+,（福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌）,35,2024/8/29,抗体在动物血清中的表达水平,36,2024/8/29,多克隆抗体的制备和保存,动物的放血：心脏取血，耳缘静脉采血（兔），尾尖取血，眼底取血（小鼠，大鼠），颈静脉取血（大型动物，羊，羊驼）。,处死动物取血的方法：颈动脉取血，摘眼球取血。,血清的分离：冰箱放置过夜，,3000rpm,30min,吸取血清，加入叠氮钠或者硫柳汞防腐剂，,-20,或者,-80,度长期保存。,37,2024/8/29,多克隆抗体的粗提：辛酸饱和硫酸铵沉淀法,将待提取样品用,60mmol/L,，,pH4.0,醋酸缓冲液稀释,3,4,倍，调,pH,至,4.5,，对含脂质较高的标本可采用二氧化硅粉或玻璃纤维吸附法除去脂质。,在室温下边搅拌边缓慢加入正辛酸，按每,ml,样品中加,25l,，若样品体积小于,5ml,，则每,ml,样品内加入,30l,正辛酸，搅拌,30min,。,10 000g,离心,30min,，取上清液通过定性滤纸过滤，装人,透析袋,，用,20,倍体积的,PBS,，,4,透析过液，中间换液,3,4,次。,然后每毫升混合液加,0.27g,硫酸铵，搅拌,30min,。,以,5000g,离心,15min,，收集沉淀物，溶于少量,PBS,中，再以,15000g,离心,20min,。上清液即为提取的,Ig,，其中大部分为,IgG,，约占,90,，少量为,IgA,及,IgM,，回收率,80,。整个操作可在,24h,内完成。,38,2024/8/29,DEAE,纤维素精制多克隆抗体,蛋白标本对,0.005mol/L,，,pH8.6 Tris-PO,4,透析。,DE52,装柱，并以,0.005mol/L,，,pH8.6 Tris-PO,4,平衡。,加样，以,0.005mol/L,，,pH8.6 Tris-PO,4,洗脱，紫外监测直至洗脱液,280nm OD,回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。,以,350ml,，,0.055mol/L,，,pH6.0 Tris-PO,4,洗脱，这一步骤可用于纯化血清,IgG,和,IgM,。,以,125ml,，,0.055mol/L,，,pH6.0 Tris-PO,4,和,125ml 0.5mol/L,，,pH5.1 Tris-PO4,梯度洗脱，总量收集,250ml,；重复步骤（,5,）。,根据,280nm,峰值合并蛋白峰，对,PBS,透析，,PEG,浓缩，,-20,度保存。,39,2024/8/29,蛋白质纯化系统,40,2024/8/29,单克隆抗体的制备,单克隆抗体的定义：序列、结构、功能、抗原结合性质都完全相同的抗体。,来源：杂交瘤细胞,表面展示抗体文库,单一,B,细胞,41,2024/8/29,单克隆抗体来源的图示,42,2024/8/29,43,2024/8/29,骨髓瘤细胞,SP2/0,1.HGPRT,基因缺陷,2.TK,基因缺陷,3.,不分泌抗体,44,2024/8/29,细胞融合的方法,病毒介导的细胞融合,PEG,介导的细胞融合,电融合,45,2024/8/29,HAT,培养基在杂交瘤细胞筛选中的作用,HAT,选择培养基的作用是筛选出（杂交瘤细胞）。,HAT,选择培养基含有次黄,嘌呤,、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻断,DNA,合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在,HGPRT,（次黄嘌呤鸟嘌呤,磷酸,核糖转移酶）和,TK,（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成,DNA,，缺少其中一种，,DNA,合成不能发生。用于杂交的,骨髓瘤,细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无,TK,或,HGPRT,，所以单个或融合骨髓瘤细胞在,HAT,培养液中将死亡。,B,细胞虽然有,HGPRT,和,TK,，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此只有杂交瘤细胞才能在,HAT,培养液中生长繁殖。,46,2024/8/29,单克隆的筛选,液体有限稀释法（细胞计数）,半固体培养基法,47,2024/8/29,单克隆抗体的鉴定,ELISA,方法的原理：,包被抗原,加入培养基,酶标二抗,48,2024/8/29,小鼠单克隆抗体的制备,杂交瘤细胞的体外培养：,RPMI1640,培养基,产量较低，条件要求比较严格，可以放大。,小鼠腹水的生产方法：,1,）腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠,0.3-0.5ml,。,2,）,7-10,天后腹腔接种用,PBS,或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠,5105/0.2ml,。,3,）,间隔,5,天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用,16,号针头采集腹水，一般可连续采,2-3,次，通常每只小鼠可采,5-10ml,腹水；,4,）将腹水离心（,2000r/min 5,分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，,-70,冻存备用，或冻干保存。,49,2024/8/29,噬菌体抗体库,Surface display antibody library,50,2024/8/29,噬菌体展示库,Phage display library,51,2024/8/29,M13,噬菌体的组装,52,2024/8/29,M13,噬菌体抗体展示载体,重链和轻链在大肠杆菌膜周质组装成,Fab,53,2024/8/29,酵母展示技术,Yeast display library,筛选方法：,FACS,54,2024/8/29,核糖体展示文库,Ribosome display library,55,2024/8/29,抗体文库筛选的优缺点,优点：,周期短，成本低,缺点：,抗体库的容量有限，亲和力低，需要体外突变以提高抗体的亲和力（,in vitro,maturation),可能引入新的免疫原性。,56,2024/8/29,单一,B,细胞筛选的方法,57,2024/8/29,B,细胞筛选的优缺点,优点：,来源于人体，免疫原性最低。,缺点：,来源有限，可能只适用于一些传染性疾病抗体的筛选，对于自身免疫病和肿瘤相关的抗原筛选比较困难。,58,2024/8/29,转基因小鼠筛选全人单克隆抗体,59,2024/8/29,小鼠内源基因的敲除（,knockout,）,ES cell,Chimeric mouse,ES cells in medium,Homologous recombination,Blastcyst microinjection,60,2024/8/29,抗体的标记技术,同位素标记,酶标记：碱性磷酸酶（,AP,）、辣根过氧化物酶（,HRP,）。,荧光素标记：,FITC,、罗丹明、,quantum dot(,量子点）、,Alexa Flor 488-650nm,。,生物素标记：,biotin-avidin,strepavidin(,链亲和素）,胶体金标记技术：氯金酸,+,柠檬酸还原。,61,2024/8/29,抗体的应用：检测,RIA,EIA,ELISA,免疫荧光,免疫组化,62,2024/8/29,EIA,和,ELISA,：抗原或抗体的检测,竞争性,EIA,63,2024/8/29,胶体金试纸条：定性检测,64,2024/8/29,电化学发光检测（,ECILA,）,是利用电化学发光剂标记的抗原或抗体与待测物经过一系列的免疫反应和洗涤等理化步骤，最后用光学仪器测量免疫反应前后电化学发光信号强度的改变，从而对抗原或抗体物质进行定量分析的一种方法。,当反应体系中加入电子供体三丙胺后，在电场作用下，钌分子和三丙胺在电极表面分别被氧化成三价钌和带阳离子的自由基三丙胺。后者很不稳定，迅速失去一个质子形成强还原剂自由基三丙胺，将三价钌分子还原成激发态的二价钌，其自身则被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的钌分子,衰减成基态钌分子，同时放出一个波长为的光子。这一过程在电极表面以每毫秒几十万次的速度循环进行，产生的光子经光电倍增管检测光强度，从而测出待检抗体或抗原的含量。,65,2024/8/29,免疫,-PCR,66,2024/8/29,PCR,免疫检测方法,67,2024/8/29,噬菌体免疫,PCR,68,2024/8/29,组织切片与免疫组化（荧光）,冷冻切片,石蜡切片,1.,取材,2.,固定,3.,水洗,4.,脱水包埋,5.,切片,6.,展片,7.,捞片,8.,铺片,9.,染色,10.,封片,11.,观察,69,2024/8/29,FACS,：,florescence activated cell sorting,70,2024/8/29,MACS:magnetic activated cell sorting,71,2024/8/29,蛋白质芯片的原理与检测,1.,二抗检测：显色、荧光或发光。,2.,质谱检测,72,2024/8/29,不同水平的基因表达调控,microRNA,Alternative splicing,Histone acetylation,and methylation,DNA methylation,1.Phosphorylation,2.Glycolysation,3.ubiquitination,73,2024/8/29,免疫共沉淀：,Co-IP,74,2024/8/29,Ch-IP,：染色体免疫共沉淀,75,2024/8/29,Western blot,76,2024/8/29,抗体药物：治疗领域,传染性疾病：埃博拉病毒,自身免疫性疾病：类风湿性关节炎,肿瘤：乳腺癌、胃癌、结肠癌,作用机理：,1.ADCC,作用杀死肿瘤细胞,2.CDC,作用,3.,阻断肿瘤细胞内的血管新生,4.,阻断肿瘤生长的信号通路,5.,解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制作用,代谢性疾病：骨质疏松、糖尿病。,77,2024/8/29,抗病毒作用,78,2024/8/29,自身免疫性疾病,79,2024/8/29,肿瘤的治疗：,ADCC,作用,80,2024/8/29,肿瘤治疗：,CDC,效应,81,2024/8/29,肿瘤的血管新生,82,2024/8/29,肿瘤自分泌生长因子,83,2024/8/29,肿瘤的免疫检查点,84,2024/8/29,代谢性疾病的治疗,85,2024/8/29,抗体药物的研发,选择疾病类型,选择相关的抗原,选择研发的方向：仿制药？创新药？,选择抗体的来源：鼠源、人源。,选择抗体的表达方式：酵母？,CHO,？转基因植物？藻类细胞？人源细胞？,选择生产的工艺：不锈钢？一次性袋子？,选择细胞培养的工艺：灌流？流加？,86,2024/8/29,发酵罐,WAVE,87,2024/8/29,细胞培养的方式,灌流,流加,88,2024/8/29,抗体的纯化,89,2024/8/29,抗体仿制药的研发,文献的调研：化合物专利、纯化专利、制剂专利、组合物专利等。,原研药的鉴定：氨基酸序列，原研药的采购。,90,2024/8/29,蛋白质的,N-,端测序,Edman,化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的,N-,端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（,PTC-,肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨（,ATZ,）转化为苯异硫尿氨基酸（,PTH-,氨基酸）三个主要的化学步骤，每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个,Edman,降解，最后通过转移的,PTH-,氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。,91,2024/8/29,92,2024/8/29,高表达细胞株的构建：,cell pool,93,2024/8/29,高表达细胞株的构建：单克隆的筛选,94,2024/8/29,抗体编码,DNA,序列的优化原则,GC,含量,密码子使用偏性,随机性,RNA,的二级结构,终止密码子的选择（双终止密码子）,DNA,的人工合成与序列分析,95,2024/8/29,人基因组,DNA,的,GC,含量：,40%,96,2024/8/29,抗体分子,DNA,序列的优化：密码子偏性,97,2024/8/29,抗体,DNA,序列的优化：,RNA,二级结构,98,2024/8/29,表达载体的构建,GCCACC,ATG,G,Kozak translation initiation sequence,99,2024/8/29,信号肽的选择,100,2024/8/29,抗体的分泌步骤,101,2024/8/29,CHO,细胞的,DNA,转染,1.,阳离子脂质体转染方法,2.,电转法,102,2024/8/29,CHO,细胞培养,103,2024/8/29,CD,培养基的主要成分,The constituents of a chemically defined media include:a basal media(such as DMEM,F12,or RPMI 1640,containing amino acids,vitamins,inorganic salts,buffers,antioxidants and energy sources),which is supplemented with recombinant albumin,chemically defined lipids,recombinant,insulin,and/or zinc,recombinant,transferrin,or iron,selenium,and an antioxidant,thiol,such as,2-mercaptoethanol,or,1-thioglycerol,.,104,2024/8/29,氨基酸,氨基酸,氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于,-20,冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在,4,冰箱中储存,2,周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。,105,2024/8/29,碳水化合物和无机盐,碳水化合物,碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。,无机盐,培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素,细胞通常可耐受,260mOsm/kg320mOsm/kg,。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加,HEPES,时需调节钠离子浓度。,106,2024/8/29,缓冲系统和维生素,缓冲系统,大多数细胞所需,pH,在,7.2-7.4,。但是，细胞培养最适,pH,值随培养的细胞种类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高,pH,（,7.4-7.7,），而传代转化细胞系则需要偏酸,pH,（,7.0-7.4,）。由于多数培养液靠碳酸氢钠（,NaHCO3,）与,CO2,体系进行缓冲，因此，气相中的,CO2,浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中,CO2,浓度设定在,5,，培养液中,NaHCO3,的加入量为,1.97g/L,；如果,CO2,浓度维持在,10,，培养液中,NaHCO3,的加入量为,3.95g/L,。细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。,HEPES,是一种非离子缓冲液，在,pH7.2-7.4,范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。,HEPES,缓冲液可与低水平的碳酸钠（,0.34g/L,）共用，以抵消因额外加入,HEPES,引起的渗透压增加。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作为,pH,指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。,维生素,在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。,107,2024/8/29,CHO,细胞的培养工艺优化,108,2024/8/29,培养工艺的放大,温度、搅拌转速、,PH,、溶氧、泡沫和液面水平。,109,2024/8/29,培养工艺优化和放大的,DOE,软件,110,2024/8/29,培养基成分的优化,氨基酸成分分析,全自动生化分析仪,111,2024/8/29,培养基的澄清过滤,112,2024/8/29,碟片式离心机,(1),进料，,(2),排出口（轻相），,(3),向心泵，,(4),碟片，,(5),储渣空间，,(6),排渣口，,(7),排渣活塞阀，,(8),离心捕集器，,(9),排出口（重相），,(10),喷嘴，,(11),计量注水,/,开启水，,(12),定时器,在离心工艺开发过程中，有很多参数需要优化，如补料的速度、离心机转速、滤饼层的去除频率等，这些参数会影响到细胞的稳定性、处理的时间以及抗体收率等。可用通过优化这些参数合理地使各种诉求达到平衡。,113,2024/8/29,切向流过滤,切向流过滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式。传统的,液体死端过滤,(dead end),是大部分微孔过滤,(MF,，微滤,),，包括除菌过滤所采用的过滤形式，其液体的流动方向与过滤方向一致，随着过滤的进行，过滤膜表面形成的滤饼层或凝胶层厚度逐渐增大，流速逐渐降低。只能处理小体积的料液。对于较大规模的料液过滤时，就需要采用切向流过滤方式，液体流动在过滤介质表面产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶层的堆积，保证了稳定的过滤速度。,切向流微滤系统主要应用于生物工程领域下游处理，如取代离心机从发酵液中收集细胞及去除细胞碎片等，特别是赛多利斯的切向流,MF,系统因其能够整体在位蒸汽灭菌，还可以应用于动物细胞连续培养的无菌换液以及提高菌体分泌物表达收率，在培养过程中无菌条件下的连续换液。,114,2024/8/29,抗体的纯化,蛋白,A,亲和层析,阴离子交换树脂,阳离子交换树脂,除菌过滤,去病毒：低,pH,值，纳滤。,抗体原液,115,2024/8/29,抗体的质量分析,Protein Concentration-70.9 mg/mL 63.0-77.0 Potency-100%80-125%ID(immunoassay)-Pass SE-HLC-MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%MP 99%CE-SDS,reduced-HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%LC+HC 98%CEX-HPLC-MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%80%CEX-HPLC ID-Pass Osmolality-314 mOsm/kg 300 50 pH-5.2 at 24.6C 5.0 5.4 Appearance-Report Volume-1.2 mL(average 1.1525 mL,n=5)1 mL Sub-visible Particulate-29 particles/container 10,m no more than 6000 particles/container 25,m no more than 600 Sterility-Pass Bacterial Endotoxin-0.2 EU/mL 5.0 CHOP ELISA-4.4 ppm Protein-A ELISA-0.5 ppm,116,2024/8/29,抗体的糖基化检测,利用毛细管电泳和质谱,(CEMS),对重组单克隆抗体,(mAb),糖基化进行分析。,此方法包括利用,N-,糖苷酶,F(PNGase F),酶解,mAb,得到多糖，对多糖进行荧光标记（,8-,氨基吡,-1,3,6-,三磺酸三钠盐，,ATPS,），并利用,CE,串联 精确质量,Q-TOF LC/MS,进行分析。,117,2024/8/29,抗体糖基化的,MS,检测结果,118,2024/8/29,抗体质量分析相关的指导原则,1-cde,人用单克隆抗体质量控制技术指导原则,20032-EP7monoclonal antibody for human use3-ICH Q6B,测试方法和接受标准：生物技术和生物,药品,4-FDAAssay Development for Immunogenicity,Testing of Therapeutic Proteins5-FDAPoints to Consider in the Manufacture and,Testing of Monoclonal Antibody Products for,Human Use,119,2024/8/29,抗体的生物学活性检测,分子水平的活性鉴定,细胞水平的活性鉴定,动物水平的活性鉴定：诱导、移植、基因修饰。,阻断活性,杀伤肿瘤细胞活性：自发瘤、肿瘤细胞株、移植瘤。,激活免疫细胞活性：原代培养的免疫细胞、白血病细胞株（,THP-1,、,Jurkat,细胞等）,120,2024/8/29,实验动物疾病模型,121,2024/8/29,抗体的制剂研究,冻干制剂,液体制剂,高浓度液体制剂,122,2024/8/29,抗体制剂的辅料,药用辅料是指在制剂处方设计时，为解决制剂的成型性、有效性、稳定性、安全性加入处方中除主药以外的一切药用物料的统称。药物制剂处方设计过程实质是依据药物特性与剂型要求，筛选与应用药用辅料的过程。药用辅料是药物制剂的基础材料和重要组成部分，是保证药物制剂生产和发展的物质基础，在制剂剂型和生产中起着关键的作用。它不仅赋予药物一定剂型。而且与提高药物的疗效、降低不良反应有很大的关系，其质量可靠性和多样性是保证剂型和制剂先进性的基础。辅料在制剂中作用分类有,66,种。,123,2024/8/29,抗体制剂的辅料,海藻糖或蔗糖（冻干保护）,磷酸盐或者柠檬酸盐缓冲系统,Tween-20,（助溶）,组氨酸（保护剂）,冷链运输的问题,124,2024/8/29,抗体制剂的稳定性分析,Protein Concentration-70.9 mg/mL 63.0-77.0 Potency-100%80-125%:molecular and cell levelsSE-HLC-MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%MP 99%CE-SDS,reduced-HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%LC+HC 98%CEX-HPLC-MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%80%Osmolality-314 mOsm/kg 300 50 pH-,Glycolyzation,Appearance-Report Volume-1.2 mL(average 1.1525 mL,n=5)1 mL Sub-visible Particulate-29 particles/container 10,m no more than 6000 particles/container 25,m no more than 600 Sterility-Pass Bacterial Endotoxin-0.2 EU/mL 5.0aggregation,Container and stopper,Accelerative stability test,Long term stability test,Impurity test,125,2024/8/29,抗体的免疫治疗方法概览,免疫脂质体,126,2024/8/29,双功能抗体和多功能抗体,127,2024/8/29,Antibody drug conjugation(ADC),第一代,ADC,：随机偶联,第二代,ADC,：定位整合,Ambrx,公司：稀有氨基酸掺入,Redwood Biosciences:,延长多肽链，偶联药物,半胱氨酸偶联,128,2024/8/29,肿瘤的转移和浸润,129,2024/8/29,Probody,技术,130,2024/8/29,抗,EGFR,抗体治疗的副作用,131,2024/8/29,CAR-T,治疗急性淋巴细胞白血病,132,2024/8/29,CAR-T,的定义,Artificial T cell receptors,(also known as,chimeric T cell receptors,chimeric immunoreceptors,chimeric antigen receptors(CARs),)are engineered receptors,which graft an arbitrary specificity onto an,immune effector cell,.Typically,these receptors are used to graft the specificity of a,monoclonal antibody,onto a,T cell,;with transfer of their coding sequence facilitated by,retroviral vectors,or lenti virus vectors.The receptors are called,chimeric,because they are composed of parts from different sources.,133,2024/8/29,CAR-T,的技术原理,134,2024/8/29,CAR-T,治疗技术的发展,135,2024/8/29,CAR-T,治疗的临床研究,ALL,（,treated with alfaCD19-CD3zeta CARs-modified T cells),B cell lymphoma(treated with