大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定.docx

大肠杆菌中重组尖吻蝮蛇类凝血酶的纯化及鉴定 高校生物工程探讨所保存。 1.2试剂与仪器 离子交换树脂填料DEAE650M、亲和层析组氨酸填料保藏于福州高校生物工程探讨所；重组肠激酶购于invitrogen公司产品；牛纤维蛋白原购于Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。 蛋白纯化系统及恒压恒流电泳仪购于东方特力科贸中心；Mini PROTEIN II电泳槽购于美国BIO-RAD公司。 1.3重组类凝血酶表达 稳定表达尖吻蝮蛇类凝血酶菌株于LB+培育基，30，诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下培育3h6，获得重组蛋白.。 1.4重组类凝血酶纯化 1.4.1阴离子层析DEAE650M 综合预试验结果，将重组菌破裂液通过阴离子层析柱，通过添加0.1M、0.2M、0.3M、0.5M和0.7M NaCl的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液阶梯洗脱，收集峰样用紫外分光光度计测定OD280，并记录数据、绘制曲线图谱，以此获得初步纯化样品，-20保藏备用. 。 全过程中运用缓冲液如表1所示。 试剂组成 平衡缓冲液20mM PBS 洗脱缓冲液20mM PBS 1.4.2亲和层析镍柱 利用重组融合蛋白表达标签能够与二价金属离子螯合，达到特异性吸附、分别功效。将阴离子层析收集含有目的蛋白样品，通过镍柱亲和层析再次纯化，全过程运用缓冲液如表2所示。样品经紫外分光光度计测定OD280，记录数据并绘制曲线图谱，收集纯化样品，-20保藏备用。 试剂组成 镍柱活化缓冲液0.1M NiSO4缓冲液 平衡缓冲液20mM PBS 洗脱缓冲液20mM PBS 1.5重组类凝血酶鉴定 1.5.1 SDS-PAGE 采纳不连续凝胶检测，分别胶浓度12.5%，蛋白条带用考马斯亮蓝染色7。 1.5.2纤维蛋白凝聚活性 1mg· mL-1的纯化产物与9mg·mL-1的牛纤维蛋白原37孵育1h，视察凝聚现象。同时以纯水、牛纤维蛋白代替目标蛋白作比照组8-9。 1.5.3肠激酶酶切 pET32a载体在融合硫还原蛋白与自身蛋白间存在肠激酶酶切位点。取纯化样品101l加入1U肠激酶，轻混后37温浴2h，利用肠激酶酶切特性，将融合蛋白酶分成两个片段，而后通过SDS-PAGE电泳对片段分子量测定，初步验证重组融合蛋白。试验以纯水代替肠激酶作为空白比照组。 1.5.4免疫印迹 纯化样品经SDS-PAGE电泳后割下相应凝胶，利用电转法将蛋白转移至PVDF膜；而后转移至封闭液中，室温下振摇1h；取出、吸净残液，将蛋白面浸没于一抗液，室温孵育1h，而后用TBST室温下振摇两次，每次10min，再用TBS室温下振摇10min；取出、吸净残液，用二抗液室温孵育1-2h，而后再用TBST室温下振摇两次，每次10min，TBS室温下振摇10min，取出进行显色.）。 2 结论 2.1重组类凝血酶纯化 2.1.1阴离子层析DEAE650M 诱导表达后菌体经超声波破裂、高速离心，结果显示目的蛋白大部分存在于上清液，为可溶性蛋白。依据蛋白质间理化性质差异，经不同盐溶液阶梯洗脱，检测OD280，收集峰样，绘制曲线，如图1所示。为判定收集样品中蛋白分布，经SDS-PAGE检验，如图2所示。 通过ExPASy-Compute pI/Mw计算可知，尖吻蝮蛇类凝血酶理论分子质量为44.3kDa，对比电泳图谱可知0.02M PBS+0.2M NaCl洗脱条件下得到主要目的蛋白样品，收集此峰样用于再次纯化 。 2.1.2亲和层析镍柱 粗纯化类凝血酶样品通过镍柱亲和层析，在不同咪唑浓度条件下阶梯洗脱，收集样品，检测OD280绘制曲线，如图3所示。获得峰样，通过SDS-PAGE检测，如图4所示。 电泳图谱中N2样品在目的蛋白理论分子量处存在较为单一条带，推断经过两步操作，可获得较纯尖吻蝮蛇类凝血酶样品。 2.2重组类凝血酶验证 2.2.1肠激酶酶切 表达蛋白样品与肠激酶在37条件下反应1h，利用SDS-PAGE检测，如图5所示。融合蛋白被剪切为分子量18kDa和26kDa两部分，且目的蛋白处存在明显因剪切而削减的痕迹，此现象与预期构建结果相契合。肯定程度上表明，表达蛋白即尖吻蝮蛇类凝血酶。 2.2.2纤维蛋白凝聚活性 利用试管法8-9处理样品，如图6所示 。阴性试验组样品呈现澄清透亮状液体，阳性试验组呈现明显浑浊胶状，样品组呈现与阳性试验组相像浑浊胶状。 结果表明，重组蛋白pET32a-acutobin对牛纤维蛋白原具有特异酶活性，能使其出现白色浑浊状态，但无法真正形成凝固。其凝聚效果与自然类凝血酶活性间仍存在差距。 2.2.3免疫印迹 经过两步纯化后样品，借助His标签抗体进行免疫印迹反应，结果如图7所示。N2样品条带均是带有His标签的相关蛋白质，推断理论分子量处条带为类凝血酶pET32a-acutobin，其余条带可能为多个目的蛋白集合体和目的蛋白分别体.。 3 结语 综上试验结果表明，利用工程菌重组表达类凝血酶，经纯化应用于实际生活的思路是可行且有成效的。依托工程菌的高效表达，以较低的环境代价为前提可获得大量用于医疗的血栓类药物，解决了干脆由活体动物提取的道德问题、提取量少、纯化不易等瓶颈问题。通过简洁的两步纯化，能够很好的解除杂质干扰，得到较为单一且具有活性的目的蛋白，既优化工艺又节约成本。然而，酶活力验证明验发觉目前纯化后重组蛋白的活力相较于成熟商品化产品仍存在差异。然而，酶活力验证明验发觉目前纯化后重组蛋白的活力相较于成熟商品化产品仍存在差异。 重组类凝血酶要正式推向市场，现阶段仍需解决酶活力提升10、保存问题，热源性、致敏性物质去除问题等 。同时，相较于原核体系大肠杆菌胞内表达的类凝血酶，可利用重组手段构建胞外分泌真核体系目的蛋白从纯化及适用性角度提升其整体价值。 参考文献 1Swenson S， Markland F S. Snake venom fibrinolytic enzymes. Toxicon，2022，45：1021-1039. 2 Serrano S M T， Maroun R C. Snake venom serine proteinases： sequence homology vs. substrate specificity， a paradox to be solved. Toxicon， 2022， 45：1115-1132. 3任予斌，张向东，刘海凤.降纤酶治疗视网膜动脉堵塞的临床探讨.眼科新进展，2022，25：356-357. 4黄如训，林健雯.急性缺血性脑血管病的降纤治疗.国外医学，2004，12：3-6. 5李家祺，李谦，唐松山，等.蛇毒类凝血酶基因工程的探讨进展J.药物生物技术，2022，20：167-173. 6程欲，缪少锋，李仁宽，等.尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化J.福州高校学报，2022，41：252-256. 7郭尧君.蛋白质电泳试验技术M.第2版.北京：科学出版社，2022，92-118. 8袁盛凌，王芃，陶好霞.蛇毒类凝血酶calobin在毕赤酵母中的表达.生物工程学报，2022， 25：526-532. 9段涛，程波，王旻，等.蛇毒类凝血酶的纯化及鉴定.化学与生物工程，2022，23：40-41. 10赵伟，曹宇虹，徐宏江 等.浙江尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯化及促凝活性J.中国药科高校学报，2022，42：565-569. 第7页 共7页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页