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油菜转基因技术研究进展 摘要 随着转基因技术的深化发展，用于转化的目的基因越来越多。目前转基因技术已运用到油菜探讨的各个领域。本文概述了油菜转基因探讨的几个方向以及基因转化方式，并探讨了油菜转基因探讨中的一些问题。 关键词 油菜；转基因技术；目的基因 中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 1017-573902-0020-03 Abstract With the deeper development of transgenic technology，the target genes used in transformation are increasing. Nowadays， transgenic technologies have been applied to various fields of rapeseed researchs. This paper summarized several directions for the transgenic research on rapeseed and gene transformations，and discussed some problems in the transgenic research on rapeseed. Key words rapeseed；transgenic technology；target gene 油菜是我国第一大油料作物，常年种植面积超过666.67万hm2，总产量约1 400万t，年产菜籽油约500万t，占自产植物油总量的45%1-6。在我国，油菜的育种和改良工作始终都受到重视。长期以来传统的常规育种技术在油菜品种选育改良方面取得了肯定的胜利，选育出了许多具有代表性的新品种，但同时也存在诸如缺乏亲本材料、远缘杂交不亲、选育年限过长等问题。转基因技术是油菜育种的协助手段，广泛应用于杂种优势、提高油脂量、油菜品质改良、抗除草剂、抗病虫等方面1-7。 1 油菜转基因的目的 近年来，基因转化的目的主要有探讨植物基因调控机理以及功能基因，选育抗病、抗虫、高产、优质等符合育种目标的品种，对受体植物进行遗传及品质改良，拓展植物分子遗传学基础理论7。在油菜转基因应用上，目前可查的就有40多种基因，这些基因主要用来改良油菜品质，提高油菜含油量，改善菜籽油品种以及其他抗虫、抗除草剂等抗性改良8-9。 1.1 改良品质 油菜品质改良是油菜育种的一个重要方向，通过转基因技术改良油菜品质的探讨已见报端。石东乔等10为获得低含量亚油酸、亚麻酸，高含量油酸的油菜种子，通过利用农杆菌介导法在油菜中导入反义的油酸脱饱和酶基因而获得转基因油菜植株。陈锦清等11为获得高含油量的转基因油菜，将反义PEP基因导入油菜。Vesna Katavic12将拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因导入甘蓝型油菜中，提高了芥酸含量。有诸多探讨报道通过特定基因的导入可明显提高油菜含油量13-14。 1.2 抗虫害 基因工程的另一个重要应用领域是培育抗虫植物，以改良作物。抗虫的CpTI、Bt基因已胜利地在油菜中进行了转化。官春云等15将Bt毒蛋白基因胜利地转化到甘蓝型双低油菜品种湘油13号，获得稳定的转Bt基因油菜品系。俄罗斯科学院植物生理探讨所已筛选出抗卡那霉素的油菜苗1-5，16。侯丙凯等1-5，17利用基因枪法将抗虫基因cry1Aa10定点整合到油菜叶绿体基因组并获得抗虫转基因植株。周小梅等18用农杆菌转化芥菜型油菜，获得具有抗病虫性的油菜转化体。有学者为获得抗虫的转基因植株19，通过用农杆菌共培育法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜而实现。 1.3 抗除草剂 为更好地选择除草剂，提高除草剂的平安性，将除草剂抗性引入农作物是一条途径，目前已培育出部分抗除草剂的油菜品种。将抗除草剂溴苯腈基因bxn转入油菜也获得抗溴苯腈转基因植株20。有探讨将抗草甘膦的EPSP合成酶基因从大肠杆菌突变株中克隆出，并将该基因导入到油菜中，成效很好，加拿大已有2个抗草甘磷的，且产量与当前品种相当，品质和抗性得到提高的转基因油菜品系1-5，21。 1.4 抗病害 抗病毒的转基因材料，可通过克隆植物抗病基因，将植物病毒的外壳蛋白基因转移到植物中获得。王新发等22获得了油菜转基因复原系和保持系植株。黄永菊等23以抗、感病品种为材料探讨油菜菌核病的遗传力发觉，油菜菌核病抗性主要受核基因限制，并存在肯定的母性效应。张海燕等24为获得抗病毒转基因油菜，通过用激光微束穿刺法将商陆病毒蛋白导入油菜中而实现。此外，通过转基因技术已获得了抗菌核病的油菜植株17，25-26。有探讨用微注射法将烟草花叶病毒基因转入白菜型油菜。 1.5 杂种优势利用 传统油菜杂种优势利用途径育种时间长、育性不稳定后代有分别、杂种纯度不高等缺陷，限制了杂种优势的发挥，利用转基因技术可很好地解决这一冲突，具有很高的探讨价值。目前，此类探讨还处于基础阶段，鲜有转育成的不育和复原系报道。Mariani等27利用核糖核酸酶和TA29启动子，获得油菜的不育和复原植株。陈社员等28将不育基因barnase导入到湘油15号，通过多代回交选育，获得遗传稳定的转基因雄性不育系15A。 2 油菜转基因方法 新的植物遗传转化方法不断被探究、发展，目的是将外源基因便利有效地导入植物体内。在转基因探讨中，植物遗传转化是关键步骤之一。转基因技术的不断发展为油菜遗传转化供应了多样化的选择，可分为农杆菌介导遗传转化或干脆通过电击、基因枪、激光微束穿刺、显微注射、花粉管、PEG介导等方法进行转化。 2.1 种质系统介导转化法 借助生物体自身的种质细胞为媒体，尤其是植物的花粉、子房、幼胚、卵细胞等生殖系统的细胞以及细胞结构来实现转化之目的，简便易行，不需建立离体培育体系。本方法主要是将外源DNA注射入种胚、子房、幼穗中，进而获得转基因植株。种质系统介导基因转化的DNA可以是重组在质粒上的，也可以是袒露的1-5。 2.2 生物介质介导的遗传转化 根癌农杆菌和发根农杆菌是目前应用的主要生物介质，它们转化的原理分别是通过活化Ti和Ri质粒的Vir区基因转移T-DNA1-5。Moloney等认为子叶柄切面的薄壁细胞的再生实力强，且很易受农杆菌感染29。Boulter等认为较之发根农杆菌，根癌农杆菌转化频率高，并能干脆从农杆菌转移基因到植物细胞核基因组30-31。 2.3 PEG介导法 Krens等1，32首先建立聚乙二醇介导法，该法操作简洁、处理量大、融合频率高，且不影响再生，基本上已克服了再生植株嵌合体的发生，其主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA1-3。该法不须要昂贵的仪器设备，但培育和处理原生质体的时间长，且处理效果无法把握，多元原生质体融合体经常形成。Nugent等33报道用PEG介导油菜原生质体和细胞核的转化，并比较对其的转化。Parihar等34探讨认为在甘蓝型油菜中，DNA摄入和外源基因表达的提高可通过低剂量的紫外线实现。 2.4 基因枪法 基因枪法最早是由Sanford等于11017年提出的，目前应用于十几种植物中。为达到稳定遗传和表达，基因枪法通过高压将包被外源DNA 的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织1-5，使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中。Cheng Lin等35利用基因枪法转化油菜子叶柄叶绿体基因组的探讨表明油菜可能是一种适合叶绿体遗传转化的作物。侯丙凯等14在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合，其通过基因枪法将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因转入油菜而实现。 2.5 激光微束穿刺法 激光微束穿刺法操作简洁、重复性好、受体材料广泛、对细胞损伤小、靶向性极强，其原理是利用聚焦到的激光微束穿刺组织，导致细胞膜的可逆性穿孔，进而导入外源DNA。但该法设备困难、转化效率不高、费用较高。王兰岚等36在世界上领先得到有分子证据的稳定转化植株，其通过一套用激光微束向植物细胞导入外源DNA的体系获得。Weber等37证明了激光微束可定向地穿透细胞壁和质膜，将外源基因导入细胞和细胞器中。 2.6 显微注射法和电激法 显微注射法是利用显微注射仪将外源基因干脆注入到生物的生殖细胞中，从而获得转基因再生植株。该方法的过程特别困难、技术难度大，必需以精细的显微操作技术和细胞低密度培育为基础，必需建立固定植物细胞或原生质体的技术，因此运用率不高。电激法是利用高压电脉冲作用，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入。电激法操作简洁、转化效率高，但仪器昂贵，较易损伤原生质体，原生质体的分别和再生较困难1，38。 3 油菜转基因存在的问题 随着转基因植物环境释放种类增多、规模增大，人们关注的热点是转基因植物释放后可能引起的种种问题。转基因植物释放后，可以通过种子或花粉将导入的基因从基因修饰植物向非且标植物或杂草扩散1-5。因此，在推广应用转基因油菜前必需严格审定程序，并评估其环境平安性。 油菜转基因体系日臻成熟，油菜转基因技术及其应用已取得了长足的进展，但目前仍有很多问题有待解决。 目前，油菜基因转化主要存在转化效率低、遗传稳定性差、无法预料基因的插入位点、定点整合等问题3-5。油菜转化体系的稳定性及转化率不高。探讨表明，湿度、光照、基因型、苗龄、受体材料等环境因子及抗生素、植物激素、Ag+离子等是影响油菜遗传转化体系建立的主要因素。应用于基因改良的油菜栽培品种越来越多，特殊是优化油菜转化体系1-5，可趋向稳定油菜遗传转化体系，特殊是农杆菌介导的花絮浸泡方法，不受限于品种。 油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性不高，随机导入的外源基因整合到油菜基因组中，会产生不确定性，表现为其表达部位、表达水平、表达时间等的不确定。另外，随机插入外源基因，其在油菜基因组中的拷贝数是不确定的1-5，经常会出现嵌合体现象或出现外源基因缄默。而采纳运用其本身特定的启动子、优化转化方法等策略，可以避开这些问题。 转基因作物的平安性始终以来是个重要问题，既要考虑到转基因油菜环境释放后是否会危害或影响其他生物1-5，又要考虑到转基因油菜环境释放后，遗传物质的横向传递对一些野生物种尤其是亲源关系很近的植物可能会造成污染。Gressel39报道了转基因油菜种子特性表达基因的漂流问题。转基因油菜在食用方面的平安性问题亟需进一步的科学验证。 植物基因工程的探讨与应用已取得了重大的进展，是大势所趋，且不行逆转。转基因油菜的探讨与生产备受各界瞩目，油菜在保障我国油品平安方面的地位举足轻重，运用分子生物技术是大势所趋40-44。 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