丙酮丁醇梭菌复合诱变及发酵废弃物原料产生物丁醇的研究.docx

丙酮丁醇梭菌复合诱变及发酵废弃物原料产生物丁醇的研究 农业废弃物为原料进行丁醇发酵，包括木薯、玉米秸秆等4。笔者采纳紫外和磁场与Fe2+共同诱变的复合诱变选育丙酮丁醇高产突变株，并探讨了运用蕨根、苹果渣、餐厨废弃物进行发酵，同时在蕨根中添加高山被孢霉干菌体进行了共同发酵，以期找寻较好的替代原料。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种。菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134购自中国微生物菌种保藏中心。 1.1.2培育基。 PYG培育基：多胨5.0 g，胰胨5.0 g，酵母提取物10.0 g，葡萄糖10.0 g，盐溶液40 mL，蒸馏水960 mL，琼脂5.0 g，pH 6.57.0，121 灭菌20 min。 筛选培育基 ：TYA培育基添加少量刃天青。筛选培育基 ：PYG培育基中的葡萄糖用可溶性淀粉替换，添加少量2-脱氧-D-葡萄糖5。 种子培育基：5%的玉米醪。发酵培育基：15%的玉米醪6。 1.2方法 1.2.1紫外诱变。 将培育48 h平板上的菌全部刮下，置于铺满玻璃珠的50 mL 0.9%生理盐水中，得30 mL原始单孢子悬液。将单孢子悬液用0.9%生理盐水或无菌水调整浓度为1.5×108个/mL。加3 mL单孢子悬液于直径9 cm平皿中，开盖置于15 W紫外灯30 cm处照耀，在暗室边搅拌边照耀0、90、180、273、360 s，用黑布包袱，置于黑暗处至少2 h。诱变结束后，用无菌水稀释孢子悬液至浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7个/mL，混合匀称，每个浓度菌悬液各涂3块平板，37 培育5 d，统计菌落数并计算致死率6。 1.2.2磁场诱变和Fe2+共同诱变。 将培育48 h平板上的菌全部刮下，置于铺满玻璃珠的50 mL 0.9%生理盐水中，得30 mL原始单孢子悬液。将单孢子悬液用0.9%生理盐水或无菌水调整浓度为1.5×108个/mL。单孢子菌悬液分别加入0.001%、0.010%、0.050%、0.101%、1.000%的Fe2+溶液，置于0.5 T磁场中37 摇床培育进行诱变。诱变结束后，用无菌水稀释孢子悬液至浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7个/mL，每个浓度菌悬液各涂3块平板，37 培育5 d，统计菌落数并计算致死率。CK：菌悬液干脆在37 下厌氧培育3 d；CK1：菌悬液置于0.5 T磁场中3 h，然后置于37 下厌氧培育3 d；CK2：向菌悬液分别加入质量分数为0001%、0010%、0.050%、0.101%、1.000%的Fe2+溶液，再置于05 T磁场中3 h，然后置于37 厌氧培育3 d。 1.2.3高产突变菌株的可视化筛选。 在筛选培育基 上进行初筛，将涂布后的平板倒置于厌氧培育箱中，37 培育73 h，挑取生长较好的单菌落接着培育，进行复筛。 1.2.4遗传稳定性试验。 将筛选得到的高产丁醇菌接到种子培育基中，37 厌氧培育3 d作为F1代，然后连续继代6次，得到F2、F3、F4、F5、F6、F7代，并且在继代的同时将各代菌株接种到发酵培育基中，37 厌氧培育73 h，采纳气相色谱测定发酵液中丙酮、丁醇和乙醇含量，依据测定结果推断其稳定性。 1.2.5发酵液中溶剂及有机酸浓度测定方法。 采纳气相色谱测定。气相色谱条件：色谱柱为安捷伦HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm；检测器为FID；N2为载气，流速为35 mL/min，H2流速为30 mL/min，空气流速为400 mL/min；初始柱温为40 ，升至73 ，保留1 min，升至140 ，然后升至200 ；进样口温度为160 ；检测器温度为220 ；进样量为0.4 L，内标法定量7。 1.2.6发酵液残糖测定。 采纳SBA-40D生物传感分析仪测定葡萄糖浓度。 1.2.7生物量测定。 采纳TCA反复冻溶法测定。 1.2.8致死率計算。 致死率=诱变前活菌数-诱变后活菌数诱变前活菌数×101% 2结果与分析 2.1诱变及突变株的筛选 2.1.1紫外诱变剂量的选择。 由图1可知，紫外照耀时间增加，菌体的致死率也随之上升。在初期致死率上升较快，但在60 s之后，随着照耀时间的增加菌体致死率改变幅度渐渐下降。60 s时，致死率已达85.0%；150 s时，致死率达1016%。依据阅历，致死率在80.0%90.0%的处理效果较佳，所以选择致死率为85.0%时的60 s作为处理时间。 2.1.2磁场与Fe2+共同诱变的剂量选择。 由图2可知，单独的Fe2+对菌体生长有肯定的抑制作用，但单独的磁场对菌体无抑制作用。当磁场和Fe2+共同作用菌体时，对菌体生长有严峻的抑制作用。由图3可知，当Fe2+浓度达0050%时，致死率在850%以上。因此，以浓度0050%作为Fe2+诱变剂量。 2.1.3可视化筛选。 刃天青是氧化还原指示剂，通过刃天青的变色状况可以得到菌产还原力的状况，当菌产还原力强时刃天青呈无色，当菌产还原力弱时呈红色。因为丙酮丁醇梭菌在生产丁醇的代谢途径中须要还原力的参加，所以当菌产还原力的实力强时，可以间接判定菌的产丁醇实力强。同时刃天青培育基对菌株生长有抑制作用，试验结果表明，050 g/L刃天青的添加量为其对菌株的最小抑制浓度，所以采纳0.50 g/L刃天青对培育基进行菌初筛。2-脱氧-D葡萄糖是淀粉的分解代谢阻遏物，若菌能在有2-脱氧-D葡萄糖的培育基中生长，说明菌克服了分解代谢阻遏，过量表达淀粉酶。试验结果表明，2-脱氧-D葡萄糖010 g/L的添加量为其对菌株的最小抑制浓度，所以采纳010 g/L 2-脱氧-D葡萄糖对培育基进行菌初筛。 2.1.4高产丁醇突变株的选育及突变株UM-80遗传稳定性检测。 动身菌株紫外诱变后经筛选培育基初筛和摇瓶发酵复筛后，获得1株性能优良的突变株，命名为Clostridium acetobutylicum UM-80。在玉米醪发酵培育基中发酵73 h，丁醇产量为9.04 g/L，总溶剂产量为17.95 g/L。丁醇和总溶剂的产量较原始菌株分别提高了5.12%和4.12%。突变株UM-80经6次传代获得的7代菌株发酵特性无明显改变，说明该突变菌株遗传稳定性好，适合进一步探讨。 2.2高产突变株UM-80发酵培育基的优化 2.2.1种龄对发酵的影响。 由图4可知，UM-80在2442 h处于对数生长期，54 h菌体浓度达到最高，但在60 h时菌的浓度快速下降，有可能是菌受到溶剂毒害，裂解死亡。接种时，选取36 h处于对数生长期的菌作为种液。 2.2.2蕨根醪初始浓度对发酵的影响。 调整蕨根醪初始浓度，其他成分不变，探讨蕨根醪初始浓度对溶剂产量的影响。由图5可知，当蕨根醪质量分数为15%时，发酵液中丁醇浓度最高，为5.50 g/L；当蕨根醪浓度低于15%时，发酵液丁醇产量较低，可以推想此时发酵液中碳源、氮源及其他养分物质不充分，发酵溶剂产量不高；当蕨根醪浓度大于15%时，丁醇产量起先下降，此时很可能是蕨根醪黏稠度增大，影響发酵液传质过程。 2.2.3不同浓度高山被孢霉干菌体和蕨根醪对发酵的影响。 蕨根中含丰富的淀粉，但缺乏其他养分物质。高山被孢霉干菌体来自于中国科学院合肥物质科学探讨院等离子体物理探讨所试验室发酵废弃物，含有丰富的养分物质，包括蛋白质、油脂、其他生长因子等。该探讨将高山被孢霉干菌 体添加到蕨根醪培育基中，考察其对发酵的影响。由图6可知，当高山被孢霉干菌体浓度为0.60 g/L时，发酵液中丁醇浓度为6.50 g/L。当高山被孢霉干菌体的浓度在00.60 g/L时，发酵液中丁醇产量呈上升趋势，可以发觉高山被孢霉干菌体对于蕨根发酵丁醇的确有促进作用。当高山被孢霉干菌体的浓度高于0.60 g/L时，发酵液中丁醇浓度呈下降趋势，推想可能是高山被孢霉中养分物质如氮源类浓度过高而无法被利用，并出现稍微抑制现象。 3结论 采纳紫外线和磁场与Fe2+共同诱变的复合诱变丙酮丁醇梭菌，同时结合有效的筛选，选育出有良好遗传稳定性的高产突变株UM-88。运用玉米醪作为发酵培育基时，丁醇和总溶剂产量分别为9.04和17.95 g/L。在运用不同浓度蕨根醪作为发酵培育基时，发觉当蕨根醪质量分数为15%时，发酵液中丁醇浓度最高为5.50 g/L。当在质量分数为15%的蕨根醪中添加不同浓度高山被孢霉干菌体，高山被孢霉干菌体浓度为060 g/L时，发酵的最终丁醇产量最高为6.50 g/L。 由此可见，蕨根与高山被孢霉的复合培育基是很好的生物丁醇发酵培育基，且都是废弃资源的再利用。 45卷5期毛碧飞等丙酮丁醇梭菌复合诱变及发酵废弃物原料产生物丁醇的探讨 参考文献 1 陈丽杰，辛程勋，邓攀，等.丙酮丁醇梭菌发酵菊芋汁生产丁醇J.生物工程学报，2022，26：1011-1016. 2 范俊辉，冯文亮，邸胜苗，等.利用甜菜糖蜜补料发酵生产丁醇J.生物加工过程，2022，8：6-9. 3 王风芹，原欢，楚乐然，等.玉米秸秆水解液燃料丁醇发酵条件优化探讨J.食品与发酵工业，2022，36：79-83. 4 马晓建，张霞，常春.丙酮丁醇梭菌发酵玉米秸秆生产丁醇J.华南理工高校学报，2022，42：27-32. 5 李汉广.高产丁醇菌株选育及其耐受丁醇机制探讨D.无锡：江南高校，2022. 6 田毅红，朱志豪，高媛，等.红薯发酵产丁醇的工艺优化J.化学与生物工程，2022，33：64-66. 7 李鑫，李志刚，史仲平.原料碳氮比对丁醇发酵两阶段发酵性能的影响J.食品与生物技术学报，2022，33：1168-1175. 第8页 共8页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页