2022年病毒学实验技术_病毒学,实验技术,2.doc

2022年病毒学实验技术_病毒学,实验技术,2病毒学实验技术 2 (2)接种和孵育用一支连接7或8号针头的1ml注射器，小心地将针头经内壳膜的裂缝插入，滴加0.10.2ml接种物于绒毛尿囊膜上。严格的操作应在检蛋灯上进行，以保证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。接种后，将鸡蛋稍行摇动，使接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。继续孵育，使蛋壳窗向上。 另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下:在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳膜。用一6号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与蛋壳分开。随后将蛋放在检蛋灯上，并在已经钻好的气室孔上吸气。当时即可清楚地见到绒毛尿囊膜的塌落。 (3)膜组织的收获将蛋平放，蛋壳窗向上。用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮膏。用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速移置于一个灭菌平皿内。 因为9或10日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是在鸡胚7、8日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。接种操作需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而不是在尿囊腔内。随后用石蜡-凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。此后按第一法所述方法进行孵育和收获。 4.羊膜(Amniotie)接种此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。由于鸡胚在发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织内增殖。脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。 (1)日龄和准备用715日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻孔。 (2)接种和孵育接种时应用lm1注射器，连接一个长约1.8cm的7号针头。将蛋平放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。刺破羊膜囊时的一个证据，就是胚胎发生一个突然运动。随后稍将针头回抽，并注入0.10.2ml接种物。蛋壳上的钻孔用石蜡-凡士林混合物封闭，将蛋直立，继续孵育。 (3)羊水的采集象尿囊腔和卵黄囊收获方法那样除去蛋壳。在气室底上滴加几滴生理盐水，使膜透明。以胚胎的眼睛作为参考依据，用连接一个短的6号针头的注射器吸取羊水。 5.其他 (1)静脉内这一鸡胚接种方法实际上不常用。操作时应用1214日龄的鸡胚。以检蛋法标记出一根大静脉。如前述方法除去该静脉上方的一小块四方形蛋壳。滴加1小滴灭菌矿物油于内壳膜上，使其变为透明。将一连接在小注射器上的4号针头顺血流方向插入于静脉内。随后注入0.10.5ml的接种物。如前述，孵育并收获。 (2)脑内这是培养狂犬病毒时偶而使用的方法。 四、组织培养 培养病毒的组织培养技术，都是下列5种基本方法的改良: (一)悬浮细胞培养法(Snspended-cellmethod)这是一个古老但现在仍在继续 应用的方法，常用于口蹄疫病毒的培养。 (二)血浆凝块培养法(Plasma-dotmethod)应用凝固血浆(经常是鸡血浆)使组织块贴附在玻片或试管壁上。先在玻璃表面涂布一层血浆膜，加入胚胎浸出液使其凝固。将组织块置入这一基质内，即能贴附于玻璃表面并增殖。应用这一方法可以看到细胞增殖，并可测量组织块的生长情况。这类培养物中的病毒生长，可根据下列几种方法测知: (a)取培养物的液体或细胞作为病毒样品，接种于已知能发生感染的易感动物;(b)注意其对细胞代谢的影响(亦即对某些代谢路径的抑制);(c)观察细胞死亡(坏死);(d)检测是否有血凝素存在;(e)对细胞或提纯的液体进行电子显微镜检查。 (三)单层细胞培养(Monolayercellcultures)静止的试管培养是病毒学中最常用的方法。这些培养物是用胰酶分散的组织制备的(来自适用的特殊来源,如肾、睾丸、皮肤、肿瘤以及其他组织)。这种培养物内含有小的细胞团块和单个细胞。将组织用剪刀剪碎，并用盐水冲洗，除去血细胞和细胞碎屑后将其置于胰酶溶液内，并用磁力搅拌装置不断搅拌。当细胞分散时(具体时间随胰酶消化的温度和所用组织而不同)，稍予离心沉淀，用营养液冲洗23次，除去胰酶，用几层纱布过滤后进一步稀释，使每m1中含有足够量的细胞，以保证良好的生长(细胞的具体数量随细胞种类而不同)，并分装培养于试管内。 由肾组织制备的细胞悬液能在静置的任何玻璃表面(平皿或试管或玻璃瓶)产生丰盛的单层细胞。这样制备的试管培养物可用于病毒的分离、滴定、中和试验以及研究病毒在细胞内的生长。 (四)直接培养(Directcultures)这种培养方法与单层细胞培养相同。在尸体剖检时采取组织或者采取活体组织，用以制备单层细胞培养物，以提高病毒分离的机会，特别是在组织内的病毒可能很少或者因存在抗体而使病毒呈不活动状态时。应用的胰酶应尽可能少，因为有些病毒可被胰酶灭活。 (五)器官培养(Organcultures)用于接种可疑病毒材料的器官培养物，也可以如前所述那样直接用病变组织制备。 现在最常用的是单层细胞培养，培养病毒以同种动物细胞为佳(即牛的病毒用牛的细胞)，以肾细胞较常用，胚胎细胞较幼年动物的细胞好，幼年动物的细胞又较成年动物的细胞好。 细胞培养对玻璃器皿洗涤要求很高，彻底洗净后用蒸馏水冲洗，再用双馏水冲洗，干燥灭菌后备用。所有溶液均用双蒸馏水配制，所用药品试剂要用高质量的分析纯试剂。操作过程中，严格要求无菌。 第 5 页 共 5 页