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药用植物毛状根技术的研究 摘要 阐述了发根农杆菌的作用机理，对毛状根诱导过程中外植体、发根农杆菌种类、预培育及共培育时间、外源激素添加、酚类物质添加及培育条件等因素对诱导率的影响进行系统的论述，并对药用植物毛状根的鉴定方法及在次生代谢物的合成机制探讨及生产、药用植物基因工程、新药物的产生、药物蛋白生产等方面的应用进行概述。 关键词 药用植物;发根农杆菌;毛状根 中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-661103-044-03 Study on Hairy Roots of Medicinal Plant Technology LI Wenlong<sup>1</sup>， WANG Yuanyuan<sup>1</sup>， ZHANG Fangfang<sup>1</sup>， ZHANG Yuehua2* et al Abstract This paper describes the action mechanism of Agrobacterium rhizogene，effects of explants， Agrobacterium rhizogene species， preculture and coculture time， exogenous hormones， polyphenols and culture conditions on the induction rate during hairy roots induction process were elaborated. The identification method of medicinal plants hairy roots， and the application in synthesis mechanism and production of secondary metabolites， the medicinal plant gene engineering， development of new drugs， pharmaceutical protein production were reviewed. Key words Medicinal plants; Agrobacterium rhizogenes; Hairy roots 基金项目 佳木斯高校校长创新创业基金项目。 作者简介 李文龙，男，山东曹县人，本科生，专业：生物技术。*通讯作者。 收稿日期 20221205 发根农杆菌是一种土壤细菌，具有广泛侵染性，能够诱导植物形成毛状根，Hildebrand于1934年在对苹果树的探讨中阐述了该现象<sup>1</sup>。发根农杆菌携带的Ri质粒侵染植物后，双子叶植物大多数能够诱导出毛状根，而单子叶植物只有少数能够在感染部位长出毛状根。发根农杆菌诱导产生的毛状根具有次生代谢物高且可以稳定存在，还具有生长速度快和易获得再生植株等优点。毛状根技术被应用于药用植物的探讨，成为药用植物探讨的一个新方向。 1 发根农杆菌作用机理 发根农杆菌上含有一个巨大的侵入质粒Ri质粒，大小为200800 kb，其上含有2个与转化有关的区域：Vir区和TDNA区。发根农杆菌作用于药用植物，感染后可在伤口部位诱导出毛状根就是由发根农杆菌Ri质粒上的TDNA区和Vir区来实现的。在自然状态下，发根农杆菌上的Ri 质粒作为基因载体可以干脆作用于药用植物伤口处细胞;在药用植物伤口组织处会产生乙酰丁香酮等酚类化合物及多糖物质，能够诱导Ri质粒内vir基因表达;vir基因表达产物再作用于TDNA区，使TDNA区的DNA片段能插入整合到药用植物的基因组，DNA片段整合到宿主细胞后表达，促使伤口处组织分化产生大量毛状根<sup>2</sup>。 2 药用植物毛状根诱导及鉴定 药用植物毛状根诱导常用的方法有3种，即干脆接种法、外植体共培育法、原生质体共培育法。干脆接种法：利用药用植物种子获得无菌苗，在茎上划出伤口，将活化好的农杆菌接种到伤口上，接着培育一段时间后就会从伤口处长出毛状根，此种方法最为简洁便捷。外植体共培育法：取药用植物的叶片、叶柄或茎段等无菌外植体与活化好的发根农杆菌进行共培育，共培育23 d后，在加有抗生素的培育基上继代培育，除掉发根农杆菌，一段时间后在外植体切口处长出毛状根。原生质体共培育法：获得药用植物原生质体，与活化好的发根农杆菌共培育，然后在加有抗生素的培育基上筛选，最终在分化培育基上获得完整毛状根或植株，该方法对原生质体要求高且筛选和除菌较麻烦。 诱导出的药用植物毛状根大多具有分支多、大量白色根毛、失去向地性生长、液体培育速度快于正常根的特点，因此，可以依据毛状根的特性从形态学水平上对毛状根进行鉴定。药用植物被感染细胞将发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合后，在细胞内会形成特异的冠瘿碱，利用硝酸银试剂或磷钼酸试剂染色法和高压纸电泳法<sup>3-6</sup>检测药用植物毛状根中是否含有冠瘿碱，从细胞水平上推断是否转化胜利。此外，还可以利用PCR扩增技术从分子水平上对诱导出的毛状根进行鉴定。 3 影响毛状根诱导的因素 3.1 外植体 在药用植物毛状根诱导时，外植体的选取非常关键。同一种发根农杆菌感染，不同药用植物同一外植体或同种药用植物的不同外植体及同一药用植株的不同发育阶段的外植体转化率都存在显著差异。同一种发根农杆菌对同属植物不同植株的同一外植体进行感染，转化效率由于植株种类存在明显差异。刘传飞等<sup>7</sup>在发根农杆菌对同属植物作用的探讨中，用R1601菌株同时感染3种葛属植物，发觉三裂叶葛、野葛和山葛叶片毛状根的诱导率分别为28%、15%和17%。同一种发根农杆菌感染同种药用植株时，一般叶片的转化率会高于茎和叶柄，幼嫩植物组织器官的转换率会高于发育成熟的植物组织器官。王莉等<sup>8</sup>在何首乌毛状根培育的探讨中，利用发根农杆菌LBA9402对何首乌叶、叶柄和茎切段分别进行感染，结果发觉叶柄和茎的诱导率分别为66.7%和46.7%，而叶的诱导率高达101%。胡忠等<sup>9</sup>在枸杞发根农杆菌转化系建立的探讨中发觉，枸杞的毛状根诱导频率与外植体的发育年龄和生理状态亲密相关。 3.2 菌株种类 不同菌种的发根农杆菌对于同种药用植物转化率不同。刘峻等<sup>10</sup>在人参Ri质粒转化系统建立的探讨中，分别运用发根农杆菌15834、LBA918、A4、R1010、1601感染人参外植体，结果有15834菌株可诱导出人参毛状根，证明不同发根农杆菌菌株对同一药用植株致根实力不同。一般发根农杆菌中的碱型菌比甘露碱型菌株具有更广泛的寄主范围，如LBA9402、A4、1601、8196、15834等常用的碱型菌。Hamill等<sup>11</sup>利用发根农杆菌碱型菌株LBA9402进行诱导试验，结果发觉双子叶植物大多都能诱导产生毛状根。 3.3 预培育及共培育时间 药用植物外植体在感染发根农杆菌之前，接种到空白培育基预培育肯定时间，可以提高转化率并解决外植体伤口处细胞因过敏反应导致的褐化问题。因为在预培育过程中，外植体伤口能够形成乙酰丁香酮等物质并释放出诱导发根农杆菌识别的信号分子。TDNA由发根农杆菌Ri质粒上转移并整合到受感染细胞DNA上须要肯定的时间，所以，外植体与发根农杆菌共培育时间的长短干脆影响到毛状根的诱导率。在诱导药用植物毛状根时，要适当延长共培育时间，以提高转化频率。共培育时间过短，Ri质粒上的T-DNA还不能完成转移与整合，则无法得到转化的毛状根;共培育时间过长，发根农杆菌增长过量易导致植物组织死亡。孙敏等<sup>12</sup>在长春花转化毛状根诱导的探讨中发觉，当预培育2 d时转化频率最高达到44.44%，当共培育2 d时转化频率最高达到50.73%。 3.4 外源激素 药用植物毛状根诱导时，在培育基中加入肯定量的外源激素，会使外植体伤口处细胞对发根农杆菌比较敏感，从而提高转化频率。刘峻等<sup>10</sup>在人参毛状根系转化系统探讨中发觉，外植体在含NAA 3×10-6 mg/L、KT 0.3×10-6 mg/L的培育基中愈伤化程度最高，转化频率也最高，达到58%。王冲之等<sup>13</sup> 在Ri质粒转化西洋参的探讨中发觉，西洋参外植体在添加2，4D 1 mg/L、KT 0.1 mg/L的MS琼脂培育基上培育，难以诱导出毛状根，而在添加NAA 6 mg/L的MS琼脂培育基中共同培育，胜利诱导出毛状根。 3.5 酚类物质 毛状根诱导发生过程中，植物外植体的伤口处会分泌某些酚类物质，这些酚类物质能够引起Vir区基因的活化，从而提高毛状根的转化频率。因而，可以人为地在诱导过程中加入促进转化的酚类物质来提高转化频率。目前广泛运用的酚类物质有乙酰丁香酮、香草酚、羟基乙酰丁香酮等。添加适量的乙酰丁香酮可以提高转化频率，但对有些药用植物诱导不仅无效且会有毒害作用。刘峻等<sup>10</sup>在进行人参转化系统的探讨中发觉，植株幼茎经1×10-4 mol/L的乙酰丁香酮处理后，转化频率明显提高。 3.6 培育条件 在毛状根诱导过程中，温度和光照也是重要的外界影响因素。发根农杆菌的增殖和活力对外界温度改变非常敏感。2530 发根农杆菌的增长最快，在28 时，vir基因表达实力最强，适当调整温度，可以提高转化频率。毛状根诱导过程中光照时间的长短也会影响诱导率，大多数植物毛状根的诱导在黑暗条件下进行，而黄遵锡等<sup>14</sup>探讨发觉紫苑毛状根在12 h/d光照条件下的诱导频率比黑暗条件下高，在全天24 h光照条件下短叶红豆杉毛状根的诱导效果最佳。 3.7 其他因素 药用植物毛状根诱导频率除以上几种因素外，还受到其他因素的影响。MS、LS等高盐培育基有助于毛状根的形成;培育基中糖类物质的含量会影响毛状根的诱导率;超声波和真空渗透处理药用植物材料能增加农杆菌与药用植物外植体之间的接触面积，提高转化频率;适当的菌种浓度也会提高转化频率，发根农杆菌菌种浓度在660 nm下的吸光度为0.50.8时，转化频率显著提高;共培育后除菌时抗生素种类和浓度的不同对转化频率有肯定的影响;培育基的pH及NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>含量对毛状根的转化频率也有肯定的影响。 4 药用植物毛状根的应用 20世纪80年头毛状根技术出现后受到高度重视，90年头起，药用植物毛状根的探讨起先趋热。统计数据表明，胜利诱导出毛状根的药用植物已有近一百零一余种，其中76%为草本植物，7%为藤本植物，其余17%为木本植物。近十几年来，人们不仅从人参、丹参、甘草、青蒿等数十种药用植物中诱导出毛状根，而且对培育条件、基因导入机理及有效药用成分含量进行了较为系统的探讨。药用植物起药效作用的一般都是其次生代谢产物，药用植物的毛状根具有次生代谢产物含量高且稳定、生长快的特点，且毛状根可以产生生物碱、蔡醒、皂普、葱酿、多糖类、蛋白等代谢产物。药用植物毛状根主要应用在次生代谢物的合成机制探讨及生产、药用植物基因工程、新药物的产生及药物蛋白生产。 4.1 次生代谢物的合成机制探讨及生产 药用植物毛状根为次生代谢产物的合成供应了新探讨材料，为药用植物的进一步探讨供应了新的思路。近年来，一些学者以药用植物毛状根为探讨材料，发觉了很多新的功能基因，并阐明白药用植物一些次生代谢产物的调控机制。王学勇等<sup>15</sup>在丹参毛状根的探讨中，得到了丹参42C甲基D赤藓醇激酶的cDNA全长序列，初步证明白丹参酮类成分的积累与SmCMK基因表达量之间呈正相关趋势。药用植物毛状根具有遗传性状稳定、次生代谢产物合成快速等优点，是次生代谢物生产工业化的一个新途径。杨蕊等<sup>16</sup>在杜仲毛状根培育条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的探讨中发觉，通过杜仲毛状根的培育来获得桃叶珊瑚苷药用成分高达30.1 mg/g，高于自然状态根及皮中含量。利用毛状根高产根系进行大规模繁殖培育，能够获得志向的次生代谢产物，有望替代传统药源及进行工业化生产。 4.2 药用植物基因工程 发根农杆菌是自然的基因工程载体，将发根农杆菌感染药用植株，使Ri质粒的基因整合到药用植物上诱导出毛状根，利用毛状根干脆进行药物生产或者利用毛状根再生出完整植株，获得优良的转基因药用植株。另外，一些药用植物通过毛状根再生的植株除次生代谢产物的改变，在植株形态特征上也有一些改变，如叶片增多、茎秆增多或叶片变小，合理利用这些改变，可以培育出更加优良的品种。 4.3 新药物的产生 药用植物诱导的毛状根培育体系内的酶系统较为困难，可以发生多种生物反应，如糖基化、葡糖化、甲基化、羟基化、乙酰化、氢化、氧化还原、水解及异构化和酯化等。在向培育体系加入不同的底物，经过多种生物反应最终获得的自然活性化合物或活性更好或产量更高或毒性更小。目前已经有多种药用植物毛状根培育体系被深化探讨，药用植物毛状根生物转化体系为新的平安牢靠药物供应了可能。 早在20世纪90年头初，人参毛状根培育体系就被探讨，在人参毛状根培育体系中将毛地黄毒苷配基作为底物，结果获得了5种酯化产物以及6种糖苷化产物<sup>17</sup>。此后，对于人参毛状根生物转化作用的渐渐深化探讨发觉，在该体系中，间羟基苯甲酸通过糖苷化、酯化反应转化产生一种新的化合物间羟基苯甲酸-D-吡喃木糖-D-吡喃葡萄糖酯。进入21世纪以后，何首乌的探讨越来越多。严春艳等<sup>18</sup>在何首乌毛状根培育体系投入8种底物探讨发觉，底物中的对苯二酚转化成熊果苷，青蒿素转化获得2种物质，而呋喃橐吾酮转化形成了2种新的化合物，证明何首乌毛状根生物体系中有多种生物酶系统存在。 4.4 药物蛋白生产 药用植物诱导的毛状根是通过有丝分裂和细胞分裂稳定遗传，靶基因表达产物大量且稳定均一。将药用植物毛状根应用于药物蛋白生产，将成为继转基因植物和微生物发酵法获得药物蛋白之后一种生产药物蛋白的重要新方法。近些年，已经有许多植物毛状根培育体系可以胜利生产药物蛋白和功能蛋白，如白细胞介素-12在烟草毛状根细胞中稳定表达，红花毛状根稳定表达生产胰岛素等。 5 问题及展望 将毛状根培育技术应用于药用植物的探讨时间较短，还存在很多问题。如很多药用植物难诱导出或不能诱导出毛状根;有些药用植物的毛状根生长缓慢，甚至出现不能正常生长;药用植物毛状根在各个领域的应用探讨还不够成熟，还不能进行大规模投入生产等。针对于这些问题，还须要不断深化的探究。随着对药用植物毛状根诱导中发根农杆菌的作用机理、各种理化因素的影响规律及次生代谢产物合成机制的深化探讨，会挖掘动身根培育技术的巨大潜力，使之成为解决药用植物众多问题的重要途径。 参考文献 1 CHILTON M D，TEPFER D A，PETIT A，et a1.Agrobacterium rhizogenes inserts T- DNA into the genomes of the host plant root cell J.Nature，11012，295：295-432. 2 陈秀清.发根农杆菌诱导毛状根探讨进展J.安徽农业科学，2022，39：9512-9514. 3 李博华，张汉明，范国荣，等.四倍体菘蓝毛状根的培育及其抗内毒素成分分析J.中国药学杂志，2000，35：738-731. 4 张汉明，许铁峰，丁如贤，等.发根农杆菌RiT-DNA对墨旱莲的遗传转化J.中药草，2001，32：924-926. 5 许铁峰，张汉明，丁如贤，等.粟米草毛状根的探讨J.其次军医高校学报，11019，20：764-766. 6 龚玉莲，施和平，李玲，等.少花龙葵毛状根的诱导和次生代谢物的产生J.热带亚热带植物学报，2002，10：58-62. 7 刘传飞，李玲，潘瑞炽，等.发根农杆菌T-DNA基因对3种葛属植物毛状根形态和葛根素含量的影响J.应用与环境生物学报，2001，7：143-146. 8 王莉，于荣敏，张辉，等.何首乌毛状根培育及其活性成分的产生J.生物工程学报，2002，18：69-73. 9 胡忠，杨军，郭光沁，等.宁夏枸杞发根农杆菌转化系的建立及影响转化因素的探讨J.西北植物学报，2000，20：767-773. 10 刘峻，丁家宜，徐红，等.Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定J.中国中药杂志，2001，26：95-101. 11 HAMILL J D，PAR A J，RHODES M J C.New routes to plant secondary products J.Biotechnology，11017，5：800-804. 12 孙敏，汪洪，王颖，等.长春花转化毛状根诱导及培育条件的优化J.西南师范高校学报，2002，27：549-552. 13 王冲之，丁家宜.Ri质粒转化西洋参的探讨I.西洋参毛状根培育系统的建立及鉴定J.药物生物技术，11019，6：80-84. 14 黄遵锡，慕跃林，周玉敏.发根农杆菌对短叶红豆杉的转化及毛状根中紫杉醇的产生J.云南植物探讨，19101，19：292-296. 15 王学勇，崔光红，黄璐琦，等.丹参4-2-C甲基-D-赤藓醇激酶的cDNA全长克隆及其诱导表达分析J.药学学报，2022，43：1251-1257. 16 杨蕊，张家辉，孙雪梅，等.杜仲毛状根培育条件优化及其桃叶珊瑚苷药用成分的探讨J.中国中药杂志，2022，34：1902-1905. 17 KAWAGUCHI K，HIROTANI M，YOSHIKAWAETAL T.Biotransformation of Digitoxigenin by Ginseng Hairy Root Cultures J.Phytochemistry，11010，29：837. 18 严春艳，马伟丽，梁建，等.转基因何首乌毛状根对8种活性成分的生物转化探讨J.中国生物工程杂志，2022：78-81. 第14页 共14页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页第 14 页 共 14 页