OsCRY基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备.docx

OsCRY基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备 摘 要：蓝光受体隐花色素是主要的光受体之一，参加植物生长发育过程中一系列的生理生化及代谢反应。本探讨克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2全基因的末端400bp到600bp，構建了pET-29a-OsCRY1a、pET-29a-OsCRY1b、pET-29a-OsCRY2基因高效表达载体，并在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达，分别获得大约20-30kD的CRY融合蛋白，纯化了CRY融合蛋白，并制备了多克隆抗体。 关键词：隐花色素 融合蛋白 多克隆抗体 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1013-908201-0-02 光受体在植物的光形态建成中起重要作用，参加植物生长发育过程中一系列的生理生化及代谢反应1。隐花色素是在全部主要的演化谱系上基因表达光调整的蓝光受体，但是其信号转导的分子机制仍旧还没被完全揭示。光经过这些受体进行信号转导，引起生理生化反应，抑制下胚轴伸长、调整开花时间、气孔开放、刺激子叶扩展、引导昼夜节律时钟和调整基因表达等2，进而调整植物的生长发育，以更好适应外界环境。本探讨克隆了OsCRY1a、OsCRY1b、OsCRY2三个隐花色素基因末端400bp到600bp，构建基因高效表达载体，在大肠杆菌中诱导蛋白表达，纯化出融合蛋白，制备多克隆抗体，为后续隐花色素基因的利用和改造奠定基础。 一、材料与方法 1.材料 1.1菌种、质粒和培育基 大肠杆菌BL21和DH5、质粒pET29a 均由本试验室保存。LB 培育基：10 g·L - 1蛋白胨， 5 g·L - 1 NaCl， 5 g·L - 1酵母粉，pH 7. 0； 120 高压灭菌20 min， 4 保存备用。 1.2酶、生化试剂及试剂盒 Taq TM DNA聚合酶、胶回收试剂盒及相关PCR引物购自上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶和T4 连接酶购自大连TaKaRa公司 ；Kan 、Amp 、PMSF来自美国AMERSCO公司；琼脂糖 、质粒提取试剂盒和Ni-NTA Superflow Cartridge购自Qiagen公司 ；ECL检测试剂盒、 NC 转印膜为GE 公司产品； IPTG购自厦门星隆达化学试剂有限公司；弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂为北京鼎国公司产品；其余药品为国产分析纯生化试剂。 1.3试验动物 3只大耳成人家兔，体重约2 kg。 2.方法 2.1日本晴水稻基因组DNA的提取 用CTAB法3提取日本晴水稻基因组DNA。 2.2表达载体构建 以含有CRY1a、CRY1b、CRY2粳稻日本晴基因组DNA模板，Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物，PCR 扩增获得目的片段，回收产物经Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1双酶切后连入pET29a表达载体，转入大肠杆菌DH5，重组质粒鉴定后，送上海生工生物工程有限公司测序。引物序列如下： Oscry1acctpET-Nde1： 5acta-CATATG-gactcct ccgacgtgcc gccgat 3 Oscry1acctpET-Xho1： 5acta-CTCGAG-GCCTTCTCTCCCAGTCCAGTTGCT 3 Oscry1bcctpET-Nde1： 5 Caac-CATATG-tcctcggag gttccaccaattg 3 Oscry1bcctpET-Eag1： 5Atta-CGGCCGa-CCAAACTGGGACTACGCCTC 3 Oscry2cctpET-Nde1： 5cgac-CATATGa-cagaatggat tcatcatcca tg 3 Oscry2cctpET-Xho1： 5 ctta-CTCGAG-TGCGGCTTTTCGTTGTCTTGA 3 2.3 融合蛋白的表达 将表达载体pET29a-cry1a、pET29a-cry1b、pET29a-cry2转化大肠杆菌BL21表达菌株4，在平板上筛选，挑取单克隆菌落，培育至对数生长期，测其OD值为0.5，加入IPTG诱导。4，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，弃上清。1 mL 菌液沉淀用101L上样缓冲液 、 101mmol/L 二硫苏糖醇、2%SDS 0.1%溴酚蓝、10%甘油） 重悬，煮沸4分钟，离心后上清液，多克隆抗体在12%SDS-PAGE中分别检测5 。 2.4融合蛋白的亲和纯化收集 101 mL 诱导表达后的菌体，离心收集沉淀。每克大肠杆菌中加3mlNPI-10或Buffer B重悬沉淀，低温超声破裂。每克菌加入8ul 50mmol/L苯甲基磺酰氟和8ul溶菌酶，在4下20min内时常地进行搅拌。一边接着搅拌一边在每克大肠杆菌中加入4mg去氧胆酸6。放置悬浮液于37并用玻棒时常地搅拌。当裂解物变粘稠时，在每克大肠杆菌中加入20ul 核酸酶，室温贮藏直至裂解液不再粘稠。离心后，将上清载入Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱，用5倍柱体积NPI-20或Buffer C冲洗3-5遍，再用NPI-250或Buffer E洗脱。最终收集洗脱组分，利用12%SDS-PAGE 进行分别检测。 2.5多克隆抗体的制备 将101µg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用并加入1ml弗氏不完全佐劑溶液，猛烈震荡使之充分乳化，用5ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，解除注射器中的气泡。将兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处7。在4个不同部位分别各注射约500µl抗原溶液。4-6周后再次注射抗原，并在注射后的7天-10天，每只兔子耳缘静脉取血0.51 mL，分别抗血清。8 二、结果与分析 1.三个CRY基因PCR扩增 以日本晴基因组DNA为模板， Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物进行PCR扩增，产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，且大小与预料基因一样，用胶回收试剂盒回收目标条带。 2.三个CRY基因表达载体的构建 质粒pET-29a和目的片段酶切连接后，转化大肠杆菌DH5。选择单克隆进行振荡培育后，分别以Oscry1acctpET-Nde1、Oscry1acctpET-Xho1、Oscry1bcctpET-Nde1、Oscry1bcctpET-Eag1、Oscry2cctpET-Nde1、Oscry2cctpET-Xho1为引物进行PCR扩增，筛选正确的克隆子。提取PCR检测阳性的克隆子重组质粒，以Nde1和 Xho1、Nde1和Eag1、Nde1和Xho1进行双酶切验证。结果显示，三个重组质粒的双酶切产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测均有双条带，且大小与预期结果一样。重组质粒上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与已报道序列一样。 3.重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 三个重组质粒转化大肠杆菌BL21，转化菌培育至细胞密度为0.5-0.6，加入终浓度为0.7 mmol·L - 1 IPTG进行诱导培育3-4小时。诱导后的细菌细胞煮沸后12% SDS-PAGE电泳，显示如图2。诱导后融合蛋白大小均在20-30KD，连接6个His标签。 4.融合蛋白的分别纯化 利用Qiagen公司的Ni-NTA Sp in Column进行三个CRY融合蛋白的分别纯化。用pH 7. 4的0. 05 mol·L - 1磷酸盐缓冲液的进行梯度洗脱9，收集纯化的重组CRY蛋白，经SDS-PAGE检测 。纯化蛋白条带单一，其纯度高，可用于多克隆抗体的制备。 5.多克隆抗体特异性分析 将制备的多克隆抗体稀释7500倍，以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白为抗原进行包被，三种多克隆抗体分别作为一抗，ELISA检测显示三种多克隆抗体分别有反应，且有交叉反应。以CRY1a、CRY1b、CRY2融合蛋白作为抗原，用三种多克隆抗体进行点杂交，发觉融合蛋白只与对应多克隆抗体有反应，证明由此方法得出结果的多克隆抗体特异。 三、结论 本探讨构建了pET-29a-OsCRY1a、pET-29a-OsCRY1b、pET-29a-OsCRY2三个高效表达载体，并在大肠杆菌中His诱导融合蛋白表达，分别获得大约20-30kD的CRY融合蛋白，并利用His标签纯化出特异的融合蛋白，免疫家兔后可获得较为特异的多克隆抗体。本探讨为隐花色素转基因水稻的功能验证奠定基础，以期进一步深化了解水稻隐花色素基因各自的功能。 参考文献 1李毓，庄春红，庄伟建，等. OsCRY2基因抑制表达对水稻主要农艺性状的影响J.核农学报.2022，25：1094-10101. 2李毓，庄伟建，庄春红，等.干扰隐花色素Cry1a与Cry1b基因的表达对水稻若干农艺性状的影响J.福建农林高校学报.2022，41 ： 153-158. 3王关林，方宏筠主编.植物基因工程，2002年8月.北京：科学出版社.742-746. 4李立芹.烟草WRKY12基因的分别、表达与多克隆抗体的制备 J.核农学报，2022，25：461-468. 5陈建飞，金先庆，丁雄辉，等.新耐药基因HA117多克隆抗体的制备与鉴定 J.第三军医高校学报，2022，33：1128-1131. 6单丽伟，唐如春，刘三阳，等.小麦种子过氧化物酶 WP1 基因的原核表达、 纯化及多克隆抗体制备 J.生物工程学报，2022，27：26-30 7CYP3A22 重组腺病毒载体构建与表达 J.医药卫生，2022，05： 284-284. 8王雅英，郭丽，吴超，等. 人博卡病毒结构和非结构蛋白的原核表达 纯化及多克隆抗体的制备 J.中国生物制品学杂志，2022，24：4101-501. 9俞俞，邢卫锋，周茜，等. 拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备 J.西北植物学报，2022，31：0261-0266. 作者简介：庄春红，福建惠安，汉族，11018年2月诞生，微生物学硕士探讨生，主要探讨方向微生物方向。 第8页 共8页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页