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响应面法对大豆花粉离体萌发主要影响因子的优化 农业科学院试验田内。 1.2 花粉采集方法 7月中上旬R2时期，于发育正常的植株上选取花蕾，花蕾大小尽量一样，并符合当日可做杂交父本的标准，用镊子取下后置于干净离心管内放于4 冰箱保存，当日运用。 1.3 花粉培育方法 采纳液体培育基培育花粉15。根据不同试验处理配制液体培育基，用移液器滴1滴在凹形载玻片上。将花蕾的萼片、花瓣剥开，用镊子夹取花药在液滴表面快速轻蘸一下，使花粉在培育基上分散开即可。为保持湿度，将载玻片放在铺有湿滤纸的培育皿中，置于恒温培育箱内25 静置培育 3 h。培育结束放4 冰箱保存。 1.4 花粉发育指标的测定 1.4.1 萌发率的测定 培育后运用莱卡DM750型显微镜进行观测。当花粉管的长度大于花粉粒的直径时计为萌发。统计萌发、未萌发的花粉粒数，萌发率计算公式如下：萌发率=萌发的花粉数/总的花粉数×101%。每个试验处理随机选取3个视野，每个视野所统计的花粉粒不少于101粒。 1.4.2 花粉管长度的测定 选取已萌发的花粉，用显微镜随机选取3个视野拍照，用Image-Pro Plus图像分析软件测量花粉管的长度。每个样品至少测定50个花粉管，计算平均长度、标准差。 1.5 单因素试验 以30 mmol/L MES为母液，加入10%蔗糖+0.05% CaCl2+0.02%H3BO4+10%PEG-4000等成分，pH值调至6.0，作为基础培育基。探讨碳源、Ca2+、植物生长调整剂等单因素对大豆花粉萌发率及花粉管长度的影响时，保持基础培育基的其他组分不变，只变更探讨因素的种类、浓度，在相同条件下培育并测定花粉发育指标16。 1.5.1 碳源的选择试验 分别运用蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、山梨醇作为碳源，浓度均为10%。 1.5.2 Ca2+源的选择试验 分别运用CaCl2、Ca2作为Ca2+来源，Ca2+浓度均为0.05%。 1.5.3 植物生长调整剂的选择试验 分别在基础培育基中加入10 mg/L萘乙酸、101 mg/L赤霉素、10 mg/L 2，4-D、50 mg/L 6-BA等植物生长调整剂17。 1.6 Plackett-Burman设计18 依据单因素试验确定的培育基组分及前期探讨确定的各组分浓度范围，对影响花粉萌发的8个因素进行考察。按PB设计支配主要影响因素的筛选试验，每个因素选取低浓度和高浓度分别作为PB试验中的低水平“-1” “+1”，响应值为花粉管长度，自变量及其代号编码和水平见表1 19。 1.7 最陡爬坡试验 依据PB试验所得的回来模型，由主要影响因素的偏回来系数确定蔗糖、GA3、初始pH值的最速增长步长20，试验设计见表2。 1.8 响应面法 通过最陡爬坡试验趋近最优点的接近区域后，采纳中心组合设计构建模型，以响应面法找寻最优培育条件21。选取花粉管长度为响应值，自变量为主要影响因素的水平。各因素编码水平见表3。 1.9 数据分析 采纳Design-Expert软件和Microsoft Excel软件统计分析数据。 2 结果与分析 2.1 花粉萌发及花粉管生长的单因素选择试验 2.1.1 碳源的选择 由图1可知，几种常见碳源中，蔗糖最易被大豆花粉利用，蔗糖处理下大豆花粉萌发率%及花粉管长度 m均为最高值；其次为麦芽糖，萌发率为%，花粉管长度为 m；葡萄糖、山梨醇等碳源对大豆花粉萌发的促进作用较小。各碳源对萌发率、花粉管长度的影响达极显著水平。由此确定大豆花粉萌发培育中选择蔗糖作为碳源。 2.1.2 Ca2+源的选择 运用CaCl2作为Ca2+来源进行培育，大豆花粉萌发率为%，花粉管长度为 m，均高于运用Ca2作为Ca2+来源的萌发率%和花粉管长度 m。由此确定选择CaCl2在大豆花粉萌发培育中作为Ca2+来源。 2.1.3 植物生长调整剂的选择 由图2可以看出，不同的植物生长调整剂对大豆花粉萌发影响不同。添加GA3后，大豆花粉萌发率、花粉管长度分别为%、 m，均高于比照的萌发率%、花粉管长度 m；添加NAA后，萌发率%比比照略有增加，花粉管长度 m有所降低；添加2，4-D、6-BA均抑制了大豆花粉萌发。因此在培育基中加入合适浓度的GA3对大豆花粉萌发有促进作用。 2.2 大豆花粉萌发主要影响因素的确定 利用Design-Expert软件对Plackett-Burman试验结果进行分析，得到响应值与各因素间的回来模型： 式中：y为花粉管长度的预料值，x1、x2、x8为自变量编码值。 由表5可知，该模型极显著；模型的调整确定系数为R2Adj=0.961 4，说明该模型能解释96.14%响应值的变化，试验误差小，因而该模型是合适的。x1、x5、x6为显著影响因素，且均为正效应，因此选取这3个因素的中心水平为原点进行下步优化。x3为负效应，取低水平值；其他因素取中间水平。 2.3 最陡爬坡试验 依据模型，得出x1、x5、x6的最速增长步长，由此形成12个试验点的最陡爬坡试验方案，实施结果见表6。由表6可以看出，直到第10个试验点响应值都是增加的，以后花粉管长度渐渐减小，说明花粉萌发的最优条件在蔗糖18.75%、GA3 62 mg/L、初始pH值为6.5旁边区域，因此采纳RSM拟合新的二阶模型进一步优化。 2.4 响应面法优化培育条件 2.4.2 响应面交互作用分析及优化 RSM图形是响应值对各试验因素x1、x5、x6所构成的三维空间曲面图，从RSM分析图上可以找出最佳参数以及各参数之间的相互作用，从RSM等高线图上可以直观地反映出各因素对响应值的影响，从而分析各交互作用对花粉管长度的影响。 由图3、图4、图5可以看出，蔗糖浓度、GA3浓度、初始pH值各因素之间存在着明显的交互作用，且在低水平范围内，同时上升各因素可以提高花粉管生长量；提高过大会抑制花粉管生长。通过对模型求导和解逆矩阵，可以得到模型的极值点：蔗糖19.2%、GA368.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、温度25 、时间 3 h，此时模型预料的最大响应值为394.56 m。采纳上述优化条件进行培育验证试验，得到花粉管长度为 391.95 m，与预料值相近，证明该模型能较好地预料花粉管生长；优化后花粉萌发水平比优化前提高32.68%。 3 结论与探讨 植物花药中花粉发育过程积累的淀粉是其萌发时重要的能量来源，淀粉积累的程度也可作为衡量花粉成熟的标记之一22。但在离体培育环境下，只具备内源的能量供应时难以完成花粉萌发和花粉管生长的过程，还须要通过人工技术尽量满意植物激素、pH值、温度等条件。对于一些自然环境下花粉难以萌发的宝贵物种，要以人工手段模拟甚至超越自然条件才能协助其完成生殖过程。因此对于花粉离体培育萌发中涉及的各种因素及其重要性，须要进行系统地分析优化。生物过程优化常用单因素法、正交法。单因素法只针对某一因素的影响，常用于确定某一因素的范围，不能反映多因素的综合效应，难以取得优化的最佳结果。正交法探讨多因素多水平组合是一种高效率、经济的试验方法，但只能对孤立的试验点进行分析，考虑因素之间的交互作用时，正交试验次数会大大增加。单因素试验确定初始培育条件后，采纳Plackett-Burman设计法，可以用较少的试验次数从众多相关影响因素中筛选出主要影响因素，为进一步的优化试验指明方向。响应面分析法是1951年Box-Wilson开发的一种用于化学过程因子优化的综合性方法，采纳多元二次回来模型的方法，拟合各因素与响应值之间的函数关系，可连续地对试验的各个水平进行分析，能快速对主要影响因素进行优化和评价，用于探讨多因子系统中因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件23，是降低开发成本、优化试验条件、提高生产效率、解决实际生产问题的更为有效的方法。近几年，响应面法不仅在化学工业、生物学、医学以及生物制药领域得到广泛应用，而且在食品学、工程学、生态学等方面也得到了应用24。同时，响应面法不仅用于各行业的优化，还可以用于动力学常数的确定、酶稳定性、动力学探讨。本试验采纳Plackett-Burman设计法、最陡爬坡路径法和响应面分析法中的Central-Composite设计相结合，对大豆花粉萌发的影响因素进行探讨，确定了培育基中添加蔗糖、CaCl2、GA3可以促进花粉萌发；并筛选出蔗糖、GA3、初始pH值为影响花粉萌发的主要因素，且三者均为正效应。响应面法确定最佳培育条件为：蔗糖浓度19.2%、GA3浓度68.9 mg/L、初始pH值6.47、H3BO4 0.015%、CaCl2 0.05%、PEG-4000 7.5%、温度25 、时间3 h，此条件下，花粉管长度达391.95 m，比优化前 295.41 m 提高32.68%。 参考文献： 1赵丽梅，孙 寰，黄 梅，等. 大豆牢固率与花粉败育率之间的关系J. 大豆科学，2004，23：249-252. 2宋淑波，刁艳辉，董金秋. 大豆杂交牢固率低的缘由及应对措施J. 现代化农业，2022，31：11. 3董德坤，高 莎，刘乐承，等. 大豆质核互作雄性不育探讨进展J. 中国农学通报，2022，28：5-9. 4孙 寰，赵丽梅，王曙明，等. 大豆花粉育性分类标准的探讨J. 大豆科学，2022，25：339-343. 5刘忠松，官春云，陈社员. 植物雄性不育机理的探讨及应用M. 北京：中国农业出版社，2001：12-18. 6孙 颖，孙大业. 花粉萌发和花粉管生长发育的信号转导J. 植物学报，2001，43：1211-1217. 7Zhang H，Liang W，Yang X，et al. 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