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核酸适体技术在食品安全分析中的应用 摘 要 核酸适体是经体外筛选技术筛选出的能特异结合蛋白质或其它小分子物质的寡聚核苷酸片段，对可结合的配体有严格的识别实力和高度的亲和力。经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的探讨手段和工具，被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等领域。高通量筛选的技术特点与Aptamer精确识别、易体外合成与修饰等特性，使得Aptamer在分析化学与生物医药探讨方面具有广袤的应用前景。本文对提高筛选效率和效果为目标的核酸适体筛选技术新进展、核酸适体技术在食品平安分析中的应用进行了回顾，展望了核酸适体在食品平安分析上的应用前景。 关键词 核酸适体； 指数富集配体系统进化； 食品平安； 残留分析;有机小分子，评述 2022-12-26收稿；2022-03-20接受 本文系厦门市科技安排项目；福建省自然科学基金项目；国家质检总局科技安排项目；国家重点基础探讨发展安排项目资助 * E-mail:Zhouy;Xudm 1 引 言 1953年，DNA双螺旋结构的提出，是现代分子生物学诞生的里程碑1,2。自此对于核酸生物大分子的探讨进入了一个崭新的时代。11010年，两个独立的探讨团队分别在Nature3和Science4上发表有关体外筛选特定靶物质结合性核酸的探讨论文，并命名此种核酸为Aptamer，它由拉丁语aptus和希腊语词缀meros组成，中文译为“适体”、“适配子“或“核酸适体”。核酸适体的筛选技术被称为“配体指数富集系统进化”4，它是以组合化学技术、PCR技术以及基因克隆测序技术等为基础的整合技术。随着近年来现代分子生物学技术的快速发展，SELEX技术也不断创新，出现了很多具有不同应用目的的核酸适体筛选方法5, 6。这些方法极大地促进了核酸适体科学的快速发展。经验了20年，核酸适体科学日渐成熟，在生物学和医学中的应用已受到广泛关注，如分子识别7,8、药物筛选7,8、靶点鉴定8,9、基因表达调控9、医学成像9、临床诊断9,10及疾病治疗10等。不仅如此，核酸适体作为一种靶物质结合分子，在分析科学领域也呈现出巨大的应用潜力，特殊是在小分子化物的分别分析中具有其独特的应用优势。 食品平安问题在21世纪已经成为全世界关注的重大问题，对消费者的身体健康产生了重大的影响。由于食品种类丰富，食品中检测的有毒有害物质种类和组分繁多，须要检测的物质质量极低，样品中待检物的浓度通常为 SymbolmA g和ng级，甚至pg 级。除此之外，很多检测物除需检测物质本身，还涉及其衍生物和降解物测定。因此食品检测要求检测方法更加精确、快速、便利。核酸适体具有靶分子广、特异性强、灵敏度高、检测成本低、平安牢靠等优点，在食品平安检测中有着良好的应用前景。本文对SELEX技术原理、核酸适体筛选技术及在食品平安分析中的应用进展进行了综述。 2 SELEX技术的基本原理 SELEX技术的总体思路是从通过组合化学原理设计合成的随机寡核苷酸库中， 经多轮筛选和指数富集， 最终获得目标核酸适体11。作为核酸适体的筛选技术，SELEX过程起始于组合化学合成的随机寡核苷酸库。库中核酸分子的结构特点是：两端为固定序列，中间为随机序列。随机序列给予每个核酸分子不同的空间结构，确定着随机寡核苷酸库的库容量及多样性。理论上， 假如寡核苷酸中的随机序列由n个碱基组成，库容量则为4n。若再考虑人为塑造的修饰文库，随机序列的多样性则更为丰富6,12。SELEX技术是分子进化工程技术的一种，技术流程包含了类似于达尔文进化理论的3个过程：自发突变、自然选择和大量增殖13。 SELEX筛选核酸适体的基本过程如图1所示6。主要包括以下几个步骤1416：运用分子生物学技术，人工设计并合成容量浩大的单链随机寡核苷酸序列的文库， 图1 SELEX基本过程 Fig.1 In vitro selection of target-specific aptamers using systematic evolution of ligants by exponential eichment technique 其中随机寡核苷酸序列长度一般在1560个碱基之间，随机序列两端固定在用于PCR扩增及其它酶学反应相关引物的结合位点。随机文库在特定缓冲体系下与靶分子温育；通过特定分别方法如离心法、滤膜法、磁珠法、毛细管电泳法、柱层析等实现与靶分子结合的核酸序列和非结合的核酸序列间的分别；对分别出的结合核酸序列进行反筛选，进一步解除掉非特异性结合的核酸序列；对获得的特异性结合的核酸序列进行PCR扩增，形成次一级核酸库，利用生成的次一级核酸库重复步骤和，随着每一轮筛选条件的不断提高,与靶目标高度特异结合的DNA或RNA分子呈指数增长。而亲和力低的序列逐步被淘汰，直到获得核酸文库对靶分子的解离常数达到目标值；对所获得的核酸序列进行克隆测序，鉴定测定序列与其靶分子结合的特异性和亲和力。 第6期徐敦明等： 核酸适体技术在食品平安分析中的应用 3 核酸适体筛选技术 SELEX技术的特点是将分子的进化过程转移到体外进行，但是在核酸适体的实际筛选中，SELEX往往受到筛选环境及技术本身限制，影响筛选效果和筛选效率。近年来， 探讨人员在传统SELEX基础上，发展出很多适合不同目的的新型SELEX技术。这些SELEX技术的出现，极大地推动了核酸适体技术在各学科领域中的应用和发展。 3.1 毛细管电泳SELEX SELEX技术中靶分子结合核酸与游离核酸的分别至关重要，是限制经典SELEX 技术发展的一个难点。Mendonsa和Bowser依据核酸适体与靶分子结合能够使其构象和质量变更并导致其电泳行为显著改变的特性，利用毛细管电泳胜利地将上述两种不同状态的核酸分子有效分别17。毛细管电泳技术的应用对于提高SELEX的筛选效率具有重要的意义。因为毛细管电泳能快速、高效地从未结合的DNA文库中分别出靶分子-核酸适体复合物，因此利用CE-SELEX 方法仅需24轮筛选就可获得靶分子的特异核酸适体。Drabovich 等依据ECEEM的特征，利用不同亲和力核酸适体的迁移率差异，收集不同时相的平衡混合物，仅3轮筛选就获得识别MutS 蛋白的核酸适体18。但是CE-SELEX技术的一个主要缺陷是注射进样体积小，限制了初始库DNA的数量，因此与传统SELEX相比一般只有1013个DNA分子数量的文库用于筛选。毛细管电泳SELEX 技术的出现，极大地提高了SELEX 筛选效率，缩短了SELEX 筛选过程，将可能成为将来核酸适体筛选的主要手段之一18。 第5页 共5页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页
