酶体外定向进化技术及其发展.docx

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1、酶体外定向进化技术及其发展 摘 要：酶体外定向进化技术可以大幅度提高酶分子的进化效率，可以在未知酶空间结构和催化机制下，根据人们的期望实现特定目标化。酶体外定向进化技术对酶工程今后的发展特别重要，对酶体外定向进化技术的探讨方法和发展前景做了归纳。 关键词：酶；定向进化；蛋白质工程；发展前景 中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：2095-683502-0001-02 酶的定向进化是20世纪90年头初兴起的一种蛋白质工程的新策略，近年来发展快速。酶能催化各种各样的化学反应，可使须要几天几个月甚至几年时间完成的转化在几分钟甚至几秒钟内完成，能催化化学方法难以完成的反应，如构象的变更等。同时

2、，它无毒无害，对环境没有污染，在环境问题日益严峻的今日，酶的应用显得至关重要。 1 概述 酶的体外定向进化又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略。简洁来说，就是在事先不了解酶的空间结构和催化机制的状况下，在试验室中通过模拟达尔文自然进化过程，让目标酶分子在预先设计好的道路上快速进化，获得有价值的非自然酶。 定向进化是随机突变和选择的结合，随机突变是人为限制某些条件变更而引发的。后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起选择预期方向的突变、解除其他方向突变的作用，整个进化过程是在人为限制下进行的。 定向突变使在自然选择条件下需几一百零一万年乃至上亿年才能完成的进化过程，缩短到几年、几个

3、月，甚至更短的时间，加速了酶的进化过程。目前，该方法主要应用于提高酶的稳定性、酶活性、对有机溶剂的耐受性，扩大底物的选择性，变更光学异构体的选择性等方面。 在目前已发觉的8 000多种酶中，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶并不多，主要缘由是自然酶的性质与工业生产环境，例如高温、高压、有机溶剂、极端pH等的要求相差甚远。自然酶的底物选择性等性质难以满意工业对蛋白酶的需求。酶的定向进化技术是酶工程学探讨的有效工具，该技术的发展使酶应用于工业生产成为可能。 2 酶体外定向进化的常用方法 2.1 易错PCR 易错PCR技术是指采纳Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，比如提高镁离子浓

4、度、加入锰离子等方式变更体系中4种dNTP的浓度等，变更Taq酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变构建出突变体库，并从中选择或筛选出所须要的突变体。由于在试验中仅经过一次易错PCR扩增，所以往往很难得到所需的突变，由此而产生了连续易错PCR扩增技术，即一次PCR获得的扩增基因作为下一次的目的基因进行操作，连续多次进行上述PCR过程，直至获得突变显著的结果基因。 易错PCR是一种相对简洁、快速、低廉的方法，但该方法较为费时、费劲，一般适用于较小的基因片段。 目前，运用易错PCR的方法已取得了肯定的成果。例如，Moore等对鼠伤寒沙门菌产生的-门冬氨酰二肽酶进行了改良，提高了酶的活力。Che

5、n等用此方法在非水相溶液中对枯草杆菌蛋白酶E的活性进行了改良。 运用该方法易出现同型碱基转换，可以说这种方法是最为基础的方法，缺点也比较明显。如何改善其费时、费劲等缺点将是改进技术的重点。 2.2 DNA改组 DNA改组是Stemmer于11014年建立的仿照自然进化的一种DNA体外随机突变方法。DNA改组也叫DNA重排，是对一组同源基因进行体外随机重组的特别PCR技术，也叫作基因洗牌术。所谓DNA改组，简洁来说，就是将DNA拆散后重排，即将目的基因在DNaseI的作用下随机酶切成2050 bp的片段混合物，然后通过多次无引物PCR循环，各片段之间互为模板和引物，在扩增的过程中进行随机组合，最

6、终获得发生多个突变位点的全长基因。 DNA改组可使酶的2个或更多的已优化性状合为一体。因此，在理论和事实上，都优于连续易错PCR。总体来说，该技术简便、高效，已渐渐成为分子改造的主干技术。利用DNA改组，Stemmer等胜利实现了对-内酰胺酶的定向进化，提高了水解头孢类抗生素的实力。Yano等人用该方法进化天冬氨酸转氨酶，结果显示支链氧代氨基酸的活力提高了105倍。 2.3 随机引发重组 RPR技术是Aronld于19101年首先报道的。其基本原理是以单链DNA为模板，随机扩增出有重叠片段模板的小片段，由于碱基错配和错误引发，使这些小片段中也存在少量的突变。在随后的PCR反应中，这些片段互为引

7、物进行合成，随之这些突变也发生重组，组装成完整的基因。 RPR技术与DNA改组相比，具有如下特点：所需亲代DNA的量较少；无需DNase I的处理，解决了DNA改组中DNase I所具有的序列偏向性；组装前不需进行纯化操作。 2.4 交织延长技术 StEP是Aronld等人于19101年建立的一种新的体外重组方法。其原理是，在PCR反应中把常规的退火和延长合并为一步，新生链再作为引物与模板进行退火和延长，如此重复进行，直到获得全长基因。Bulter等通过易错PCR、交织延长重组等方法对漆酶进行了体外定向进化，筛选得到的突变酶的总活力比原酶提高了160倍。 近年来，新技术大量涌现，以上述几种方法

8、为基础的各种新方法不断出现，如过渡模板随机嵌合生长技术、外显子重排、退火低核苷酸基因重排和增加平截杂合酶法等方法。通常，在酶定向进化过程中，各种方法并不是独立的，也没有哪一种方法是万能的，因而可通过多种方法的组合，使酶的性质得到更大的提高。 3 探讨 基因文库的构建是酶体外定向进化的基础。在众多的基因文库构建技术中，易错PCR是最早出现的一种，其后产生的各种各样的新技术，或是以其为基础，或是对其进行改良。时至今日，易错PCR技术仍常被用于文库的构建。每种方法都有其独特之处，例如，DNA shuffling是一种产生杂合酶的有效方法，但只能重组2个亲本基因，而且只限于产生单杂交文库；RPR技术可

9、运用单链DNA且不须要DNase I的处理；StEP法是一种只依靠于条件严格限制的PCR的不同的体外重组法。选择合适的方法会使定向进化过程变得更加简洁，使结果更趋于志向。 4 结束语 胜利的定向进化须要满意功能实际、目标功能可行、合适的筛选方法等条件。在肯定程度上，现实中自然进化的难易度确定了定向突变能否解决实际问题，因而在做选择之前，要先对所需优化性状进行可行性分析，应选择易于优化的性状进行改良。通常来说，运用上述技术可实现已有性状的优化，但是创建全新性状的新酶，是一项艰难的工作，因为一种新的功能须要新的依次空间，而人们很难预料须要重复多少次才能得到预期的答案，可能会很幸运，很快就得到，也可

10、能会是一个漫长而艰难的过程。 上述定向进化方法几乎可以运用到生命科学探讨的各个领域。目前，体外定向进化的方法不仅被胜利地运用在酶的改造上，而且还被胜利地运用于DNA的进化、酶以外蛋白质的进化。我们坚信，这些技术方法的进一步完善和更广泛的运用，必将推动许多领域的发展，实现人类相识自然、改造自然史上的又一次飞跃。 参考文献 1胡军.酶技术发展与酶定向进化J.工业微生，11019，29：37-42. 2平丽英，柳志强，薛亚平，等.酶的分子定向进化及其应用J.基因组学与应用生物学，2022，28. 3苏龙，庄宇，何冰芳.酶的定向进化探讨及其在工业生物催化中的应用J.生物加工过程，2022，9：69-7

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12、展，2002，29：518-522. 编辑：曹月 Enzyme in Vitro Directed Evolution Technology and Developmen Cheng Mengting Abstract： The enzyme in vitro directed evolution technology can greatly improve the efficiency of the evolution of enzyme molecules， the enzyme may be unknown spatial structure and catalytic mechanis

13、m， in accordance with peoples expectations of achieving specific goals. Enzyme in vitro directed evolution technology for the future development of enzyme engineering is very important enzyme in vitro directed evolution methods and technology made prospects are summarized. Key words： enzyme； directed evolution； protein engineering； development prospects 第8页 共8页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页