产几丁质酶细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究.docx

《产几丁质酶细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《产几丁质酶细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究.docx（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、产几丁质酶细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究 农业等领域，具有普遍的生物学活性及可观的经济效益3-7。 海产品加工产生的虾壳、蟹壳等下脚料是富含几丁质的废弃物，这些未经处理的下脚料，不仅造成资源奢侈，而且污染环境。采纳几丁质酶水解处理，不仅可以有效处理废弃物爱护环境，而且还可以变废为宝，生产高附加值的壳寡糖等系列产品。 自从Benecke首次报道分别到几丁质酶产生菌以来，发觉在微生物中许多细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒都能够产生几丁质酶8，9。本试验从土壤中筛选出一株产几丁质酶的菌株，经16S rDNA测序，对该菌进行鉴定，并对其酶活和酶学性质进行了测定，为酶法降解几丁质制备几丁寡糖以及该酶在

2、其他领域的应用供应理论和实践的指导。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土样 采自武汉设计工程学院校内竹林处、污水处理池旁边和汤逊湖边表层510 cm土壤以及埋有虾壳30 d土壤，分别出产几丁质酶的菌株。 1.1.2 培育基 富集培育基：蛋白胨 1 g、酵母膏1 g、NaCl 0.5 g；初筛平板固体分别培育基：蛋白胨1 g、酵母膏1 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O 0.01 g、琼脂15 g、3%胶体几丁质80 mL；发酵培育基：蛋白栋0.5 g、酵母膏0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.

3、3 g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O 0.01 g、3%胶体几丁质80 mL；蟹壳发酵培育基：蛋白胨0.5 g、酵母粉0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O 0.01 g、蟹壳20 g。 1.1.3 胶体几丁质的制备 片状几丁质5.0 g、浓磷酸40 mL置于50 mL小烧杯中，用保鲜膜将杯口封好，28 放置24 h。24 h后取出，5 000 r/min离心10 min，取上清液，加NaOH和去离子水调pH至7.0， 5 000 r/min离心10 min，取沉淀即为胶体几丁质。 1.2 方法

4、1.2.1 产酶菌种筛选 将待测样品加无菌生理盐水并用玻璃珠打散，静置2 min后取上清液加入富集培育基中，在37 恒温摇床上培育24 h。将富集后的菌液稀释成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8系列稀释菌液，分别匀称涂布在初筛平板固体分别培育基中，放入37 的恒温培育箱中培育36 h，然后用0.1%刚果红染色2030 min，再用1 mol/L NaCl脱色1015 min，选择能产生透亮圈的单菌落。 1.2.2 酶活的测定 取出初筛得到的菌株，接种至液体发酵培育基中，置于37 的恒温摇床上振荡培育48 h后，测定发酵液的酶活。1 mL酶液在37 、pH 7.0的条件下每分钟产生

5、相当于l mol N-乙酰氨基葡萄糖还原糖所需的酶量定义为单位酶活。几丁质酶酶活的测定方法10如下：取5 mL摇瓶培育液经5 000 r/min离心10 min；取0.5 mL上清液，加入1 mL Mcllvaine缓冲液、0.5 mL 3%胶体几丁质，于37 水浴30 min，然后沸水浴10 min，取1 mL 4 000 r/min离心5 min，加0.5 mL DNS试剂终止反应；沸水浴5 min立即冷却，加入4 mL去离子水后测OD540 nm；以N-乙酰葡萄糖含量为横坐标，光密度OD为纵坐标绘制标准曲线，用空白管作零点。 1.2.3 酶学性质的测定 1）pH对酶活性的影响。以0.2

6、mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L柠檬酸配制pH 3.08.0梯度缓冲液，以0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L Gly配制pH 8.510.0梯度缓冲液，根据上述标准方法测定酶活，依据不同pH缓冲液的吸光值，测定酶的最适反应pH。 2）温度对酶活性的影响。以最适pH缓冲液配制溶度为3%胶体几丁质底物，根据标准曲线测定方法测定在不同温度下的酶活。确定酶反应的最适温度。 3）酶的pH稳定性。各取1 mL酶液于pH 3.010.0的缓冲液中4 放置12 h。以最适pH缓冲液配制3%胶体几丁质底物测定活性，以未用缓冲液处理的酶液的酶活为101%，计算相对酶活。 4）酶的热稳定

7、性。在确定酶的最适pH的前提下，以氢氧化钠、甘氨酸为底物缓冲溶液调整pH为最适pH，各取1 mL的原酶液放入3080 的水浴锅中保温30 min，然后再加入最适pH配制的3%胶体几丁质的底物，在最适温度下测定酶活，以未处理的酶液的酶活为101%，计算相对酶活。 1.2.4 菌株降解蟹壳实力的测定 取蟹壳发酵培育基50 mL分装至250 mL的锥形瓶中，按1%接种量接种后置于37 摇床振荡培育，以未接种的培育基作为空白比照，测定培育15 d后发酵上清液的还原糖。 1.2.5 产酶菌株的初步鉴定 采纳菌体干脆扩增16S rDNA的方法11。PCR扩增引物选用16S rDNA细菌通用引物27f/14

8、92r。反应体系：25 mmol/L MgCl2 5 L，10Buffer 2.5 L，25 mmol/L dNTP 2 L，上下游引物各1 L，模板DNA 1 L，Taq酶 0.25 L，ddH2O 12.25 L，总体系为25 L。PCR反应条件：94 2 min，94 30 s，52 30 s， 73 1 min，共30个循环。PCR产物采纳试剂盒纯化后送至深圳华大基因科技有限公司进行测序，将测序结果同GenBank数据库的基因序列进行比对，以确定该菌类型。 2 结果与分析 2.1 产酶菌株的筛选 将富集培育的细菌经过梯度稀释后接种到筛选培育基上，筛选出7株可以产透亮圈的菌株分别命名为1

9、、2、3、4、5、6、7。测定7株菌的菌落直径以及透亮圈直径和菌落直径比，结果如表1所示，1号菌的透亮圈与菌落直径比较大。在几丁质平板上，菌落四周形成的透亮圈除与菌株产酶水平相关外，还与菌株分泌的几丁质内切酶与外切酶比例相关，所以不能仅以菌落四周透亮圈大小推断菌株的产酶实力，筛选时必需综合考虑透亮圈大小、光明程度、菌落大小以及菌落下培育基的液化程度12。因此，对所选取的7株含有透亮圈的菌株进行复筛，从中选出目的菌株。 2.2 酶活测定 2.2.1 标准曲线制作 测定不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度，绘制标准曲线如图1所示。从标准曲线可以看出，NAG的含量和吸光度呈线性关系，回来方程为y=1

10、.936 9x-0.040 0，R2=0.1013 8，式中，x为葡萄糖含量，y为OD540。 2.2.2 发酵液粗酶活 对选择的7株含有透亮圈的菌株放入发酵培育基中培育，取上清液，利用标准曲线的测定方法测定吸光值，通过计算得到的酶活如图2所示。由表1、图2可以看出，4号菌株的透亮圈与菌落直径比较2、5、6号菌株透亮圈与菌落直径比大，而其酶活却较之小，由此可知，透亮圈与菌落直径比与酶活力的凹凸并非呈正相关。通过酶活的测定得到1号菌株的吸光值最大，表明在相同时间内，该菌株产生的酶活最大。因此选用1号菌株作为目的菌株。 2.3 酶学性质测定 2.3.1 pH对酶活性质的影响 将1号菌株放在不同pH

11、梯度下，利用标准曲线的测定方法，测定不同温度下的吸光度。所测结果如图3所示，随着pH上升，酶活力不断上升，在pH 7.5以后起先下降。在pH 7.58.0时酶的活性较高，在pH 7.5时最高，所以该酶最适pH为7.5。该酶在pH7.5活性起先下降，pH为10时仍有较高的活性，说明该菌耐碱性实力较强，在中性和碱性条件下更简单产生几丁质酶。 2.3.2 温度对酶活的影响 将pH固定在最适pH 7.5，利用标准曲线的测定方法，测定不同温度下的吸光度，绘制不同温度下的酶活曲线。结果如图4所示，该酶在2060 时活性特别高，但在30 时最高，所以该酶最适温度为30 。该酶60 活力下降很快，在73 以后

12、活力微小。该几丁质酶的最适反应温度为30 ，略高于蜂房芽孢杆菌产生的酶，低于黄杆菌产生的酶，据报道蜂房芽孢杆菌的酶活最适温度为28 3，黄杆菌的最适酶活温度为50 2。 2.3.3 酶的pH稳定性 酶液在不同pH缓冲液中4 保存12 h后，测得残余酶活，绘制相对酶活曲线。由图5可知，pH 6.59.5的缓冲液中放置12 h后，残余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.08.5的缓冲液中残余酶活仍在80%以上，说明该酶在中性和碱性条件下特别稳定。 2.3.4 酶的热稳定性 在最适pH条件下，通过标准曲线的测定方法，测定不同温度下保存30 min后的酶活，绘制不同温度下的相对酶活曲线。由图6可知，

13、该酶在低于60 的处理条件下残余酶活仍在80%以上，且80 处理后仍有37%的残余酶活，说明该酶的热稳定性较好。 2.4 产酶菌株的初步鉴定 将16S rDNA的测序结果通过Blast软件与GenBank数据库比对，发觉该序列与芽孢杆菌属同源性最高，达到101%，初步确定该菌为芽孢杆菌属菌株。 2.5 菌株降解蟹壳的实力 取1 mL发酵液上清液与DNS反应，依据标准曲线计算得出，每瓶发酵液总还原糖为5.3 mg，即该菌降解1 g蟹壳产生5.3 mg还原糖。表明该菌株可以干脆降解蟹壳，但降解效果不是很好。 3 小结与探讨 通过平板透亮圈法初筛、复筛，从土壤中获得一株透亮圈最大的1号菌株，依据菌株

14、和菌落的形态以及革兰氏染色，初步鉴定该菌株为紫色短杆菌，经过16S rDNA的测序，初步确定该菌为芽孢杆菌属菌株。 本试验中所探讨的细菌产几丁质酶的最适pH为7.5，略高于蜂房芽孢杆菌和黄杆菌，蜂房芽孢杆菌产的酶的最适pH为6.89，黄杆菌产的酶的最适pH为7.02。该几丁质酶的最适反应温度为30 ，略高于蜂房芽孢杆菌的酶活最适温度28 9，而低于黄杆菌的最适酶活温度50 2。 酶是一种活性蛋白，因此酶的稳定性在探讨酶的过程中起重要作用，而温度和pH是影响酶稳定性的两个主要因素。本探讨中，几丁质酶在pH 6.59.5的缓冲液中放置12 h后，残余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.08.5的

15、缓冲液中残余酶活仍在80%以上，说明该酶在中性和碱性条件下特别稳定；同时该酶在低于60 的处理条件下残余酶活仍在80%以上，且80 处理后仍有37%的残余酶活，说明该酶的热稳定性较好。众所周知，蟹壳中几丁质的含量很高，但是目前未见有利用菌干脆降解蟹壳的报道。本探讨首次将筛选的菌干脆用于降解蟹壳，结果表明，该菌具有降解蟹壳的实力，但是效果不是很好。缘由可能是蟹壳没有经过任何处理，结构紧密不适合干脆降解，或者培育条件不合适，没有达到最佳降解条件，还有待于进一步的探讨。 参考文献： 1 杨 革，陈洪章，李佐虎.金龟子绿僵菌深层培育产几丁质酶的探讨J.高校化学工程学报，2022，19：362-367.

16、 2 陈三凤，李季伦.黄杆菌几丁质酶的纯化和性质J.微生物学报，11014，34：14-19. 3 曹 俊，周南进.壳聚糖抗肿瘤作用的探讨进展J.中国生化药物杂志，2022，26：126-127. 4 CHEN A S，TAGUCHI T，SAKAI K，et al. Effect of chitobiose and chitotriose on carbon tetra chloride-induced acute hepatotoxicity in ratsJ.Biological and Pharmaceutical Bulletin，2022， 28：11011-11013. 5 张

17、丽.壳寡糖的制备及对动物养分功能的探讨进展J.山东畜牧兽医，2004：43-44. 6 郑晓广，沈新元，杨 庆.甲壳质及其衍生物在保健领域中的应用J，河南师范高校学报，11019，27：46-50. 7 姚婉生，王 雪，侯海荣，等.几丁寡糖制备的探讨进展J.山东科学，2022，19：27-31. 8 林 毅，陈金辉，黄志鹏.芽孢杆菌几丁质酶及其在植物病虫害生物防治中的应用J.福建农业科技，19101：32-33. 9 郑志成，周美英，姚炳新.蜂房芽孢杆菌B-91几丁质酶的合成条件J.厦门高校学报，11015，34：447-451. 10 吴志刚.几丁质/壳聚糖酶产生菌的分别及发酵条件、酶学性质

18、探讨D.杭州：浙江高校，2003. 11 MAGALHAES C L，DE SOUZA E M，WEBER O B，et al. 16S ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from bananaand pineappleMerril）J.Applied and Environmental Microbiology，2001， 67：2375-2379. 12 杨水英，李振轮.产组成型几丁质酶菌株的筛选及产酶条件优化J.西南高校学报，2022，29：159-163. 第10页 共10页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页