不同基因型变异链球菌临床分离株的分离和鉴定.docx

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1、不同基因型变异链球菌临床分离株的分离和鉴定 摘要 目的 分别鉴定变异链球菌临床分别株。方法 收集高龋患者和无龋健康人口腔中牙菌斑标本进行厌氧培育，通过细菌形态学视察、生物化学鉴定、自动微生物分析系统分析、聚合酶链反应扩增变异链球菌基因的特异性片段表面蛋白抗原/、葡糖基转移酶B和葡聚糖酶以及基因分型等方法对获得的变异链球菌临床分别株进行鉴定。结果 从32例临床受试者口腔中分别获得46株变异链球菌临床分别株，经生物化学，自动微生物分析系统，变异链球菌的特异性基因spaP、gtfB和dexA的PCR扩增均鉴定为变异链球菌，基因分型发觉其中5株临床分别株的基因型与其他菌株相同。结论 获得41株不同基因

2、型变异链球菌临床分别株。 关键词 变异链球菌； 基因型； 分别； 鉴定 中图分类号 R 780.2 文献标记码 A doi 10.7518/hxkq.2022.01.020 变异链球菌是人类口腔中最主要的致龋菌1。变异链球菌群中各菌种的分别与 鉴定是进行龋病探讨的基础。细菌菌种的鉴定方式经验了由传统的表型、血清型方法到以分子生物学为基础的基因型方法的转变。本文采纳形态学、生物化学、自动微生物分析系统、扩增变异链球菌基因的特异性片段区域以及基因分型等方法对获得的变异链球菌临床分别株进行鉴定，为龋病临床和基础探讨供应材料。 1 材料和方法 1.1 试验菌株 变异链球菌国际参考株Ingbritt，金

3、黄色葡萄球菌临床分别株188号。 1.2 病例选择 纳入标准：高龋患者，龋失补牙指数6；无龋健康人， DMFT指数=0。解除标准：饮食结构异样，有嗜甜 食及睡前进餐等不良饮食习惯者；接受放疗和化疗的患者；舍格伦综合征患者；严峻全身系统性疾病者；近3个月内服用抗生素者；接受正畸治疗者；口腔卫生状况不良者；牙齿结构异样者；涉及取样的牙体有牙髓病变、根面暴露或根面龋、未限制的牙周病变、冠或固定桥等修复体者。 依据纳入及解除标准，从临床初次就诊的患者中选取受试者，受试者的取样位点均为无龋损的釉质光滑面。采集菌斑前，均向受试者及其陪伴人员说明试验目的和过程，取得同意并签署知情同意书。 40例受试者参与试

4、验，其中高龋患者26例，无龋健康人14例。 1.3 菌斑采集与处理 受试者清水漱口，去除食物残渣，棉卷隔湿并用无菌生理盐水冲洗收集区，更换棉卷，隔湿，用无菌刮匙刮取釉质光滑面菌斑后，马上将其置于预先消毒灭菌，盛有1 mL改良液体Cary-Blair运输培育基，上覆液体石蜡的Eppendorf管中密封。标本在2 h内转送至试验室。所取的菌斑样本经振荡器混匀1 min后，用无菌生理盐水做10倍系列稀释。 1.4 变异链球菌的分别 1.4.1 细菌初代培育 取原液、10-1、10-2、10-3稀释液各101 L，接种于胰蛋白酶水解物-酵母提取物-半胱氨酸-蔗糖-杆菌肽琼脂培育平板2内，置于厌氧环境下

5、37 培育48 h，然后进行菌落形态的视察。 1.4.2 细菌次代纯化培育 将经初代培育的具有典型菌落形态的单个菌落接种于轻型唾液链球菌-杆菌肽琼脂 培育平板2内，置于厌氧环境下37 培育48 h，然后 进行菌落形态的视察及革兰染色检查。 1.5 变异链球菌临床分别株的鉴定 1.5.1 形态学鉴定 纯化培育的细菌经革兰染色，于油镜下视察菌体染色、形态和排列状况。 1.5.2 生化鉴定 用无菌接种环收集培育48 h的MSB培育平板表面的菌落，混悬于1.0 mL的无菌生理盐水中制成0.5麦氏浊度的均一细菌悬液。取待测细菌悬液分别滴入须要试验的盛有甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖、七叶苷和精氨酸的安瓿

6、瓶中，每瓶3滴，以进行临床分别株的糖酵解试验和水解试验，经37 培育24 h后视察结果。此外，将菌悬液滴加于清洁的载玻片上后，滴加体积分数3%过氧化氢，视察有无气泡产生。以变异链球菌国际参考株Ingbritt为阳性比照，无菌生理盐水为阴性比照。 1.5.3 自动微生物分析系统鉴定 经传统生化鉴定确定为变异链球菌的临床分别株，再分别用API 20 Strep鉴定条或VITEK 2全自动微生物分析仪进一步鉴定，以确保结果的精确性。试验方法参照仪器运用说明书进行。API 20 Strep的结果分别于4 h和24 h读取；VITEK 2全自动微生物分析仪的测定结果于8 h内读取。经上述鉴定方法证明为变

7、异链球菌者，用体积比11的甘油脑心浸液液体培育基保种，于-73 冻存备用。 1.5.4 分子生物学鉴定 通过聚合酶链式反应方法扩增变异链球菌基因的特异性片段区域，包括表面蛋白抗原/基因3、葡糖基转移酶B基因4和葡聚糖酶基因5，目的片段大小分别为192、517和1 273 bp。以变异链球菌国际参考株Ingbritt为阳性比照，金黄色葡萄球菌临床分别株188号为阴性比照。 第4页 共4页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页第 4 页 共 4 页