嗜酸乳杆菌表层蛋白结构与生物学特性研究.docx

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1、嗜酸乳杆菌表层蛋白结构与生物学特性研究 打开文本图片集 摘要：目的：阐明嗜酸乳杆菌表层蛋白的一级结构、高级结构，探讨嗜酸乳杆菌表层蛋白的高级结构对嗜酸乳杆菌生物学特性的影响。方法：通过耐盐和耐胆盐试验测定嗜酸乳杆菌的耐盐性和耐胆盐性，MAT法测定嗜酸乳杆菌的表面疏水率，自凝合试验测定嗜酸乳杆菌的自凝合率，共凝合试验测定嗜酸乳杆菌的共凝合率。结果：嗜酸乳杆菌亲本株的耐受性、表面疏水率、自凝合力与共凝合力均高于去表层蛋白的嗜酸乳杆菌菌株。结论：嗜酸乳杆菌表层蛋白对提高嗜酸乳杆菌耐受性、疏水率、凝合力有显著影响。 关键词：嗜酸乳杆菌;表层蛋白;耐受性;疏水性;凝合性 中图分类号：Q936 乳酸菌作为

2、益生菌的一大类，广泛分布于自然界，是存在于人类及动物肠道中的重要的生理性菌群。除了能赐予发酵食品特有的风味与养分，提高食品的贮存实力外，乳酸菌还具有黏附、抑菌、维持肠道微生态稳定，调整人体免疫力等附加益生功能。因此，益生性乳酸菌被大量地应用于乳制品加工、蔬菜深加工及发酵肉制品的加工等领域，使人们在享受美味的同时获得养分与健康，以乳酸菌为代表的益生菌也越来越受到人们的认可与重视，挖掘乳酸菌及其发酵产品的益生功能已成为国内外养分与食品科学探讨的一个重要项目。 探讨表明，细菌的许多生物学功能都与其表面的成分相关，其中菌体细胞表层蛋白起着至关重要的作用。从已有的报道来看，不同菌种的细胞表层蛋白在生物学

3、功能方面表现出肯定的差异性。多数细菌和古生菌细胞壁的外表都覆盖一层表层蛋白，是一种可经自组装形成对称次晶格阵列结构的蛋白或糖蛋白，可起到爱护菌体的作用。还有些细菌的细胞表面成分可充当致病菌的毒力因子，为菌体分泌物供应储存空间，调整宿主免疫反应。 乳酸杆菌的细胞表面主要由厚的多层囊状肽聚糖组成，磷壁酸、胞外多糖和其它蛋白类成分通过各种机制锚定到细胞壁上，这些细胞表面结构，特殊是蛋白类物质，可通过不同的机制，参加乳酸杆菌的生物学功能。但并非全部的乳杆菌都具有表层蛋白结构，且探讨多集中于少数菌种，更多的携带表层蛋白的乳杆菌有待被发掘和探讨;乳杆菌表层蛋白的结构与菌株功能性质之间是否有关联，也尚需进一

4、步探讨。 本文拟通过耐盐和耐胆盐试验、MAT法、自凝合试验和共凝合试验测定出嗜酸乳杆菌及去表层蛋白嗜酸乳杆菌的耐受性、疏水性及聚集实力，从而考察表层蛋白对嗜酸乳杆菌的聚集实力、菌体表面性质等特性的影响，从一个崭新的视角来探究表层蛋白对嗜酸乳杆菌益生作用的贡献，为嗜酸乳杆菌及其表层蛋白在食品德业的应用供应理论基础。 1材料与方法 1.1嗜酸乳杆菌的复苏与培育 将保存在-73冰箱中的嗜酸乳杆菌菌种取出后，置于37水浴箱中解冻。于超净工作台上吸取200L菌液，接入10mLMRS液体培育基中，37厌氧培育18h。再取一环培育物于MRS固体平板上划线，37下厌氧培育18h，然后重复上述操作。最终挑取培育

5、后的单菌落接种于MRS液体培育基中，37下厌氧培育18h。 将保存在-73冰箱中的副溶血性弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌种取出，置于37水浴箱中解冻。于超净工作台上吸取200L菌液接入10mLMRS液体培育基中，37下培育18h。 1.2去除嗜酸乳杆菌表层蛋白 将嗜酸乳杆菌菌悬液离心，收集菌体，PBS洗涤两次，用5molL-1的LiCl在35下处理菌体20min。 1.3绘制嗜酸乳杆菌生长曲线 筛选出产乳酸的嗜酸乳杆菌菌株，测出此时菌液的OD值，此后每隔2h测定一次菌液的OD值，直至24h，每个重复测定3次，取平均值，绘制成菌株生长曲线。 1.4菌株耐盐性测定 将嗜酸乳杆菌菌株和经

6、去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株接种在含有不同浓度NaCl的培育基中，每个试管中加入101L菌液，在30、160rmin-1培育，16h后视察菌株的生长状况并测其OD值。 1.5菌株耐胆盐性测定 将嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株接种在含有不同浓度猪胆盐的培育基中，每个试管中加入101L菌液，在30，160rmin-1培育，16h后视察菌株的生长状况并测其OD值。 1.6MAT法测定菌株表面疏水率 将嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株液以3000rmin-1的转速离心10min，收集菌体，用高浓度的NaCl洗涤2次后，重悬于高浓度的NaCl溶液中。调整菌液使之在60

7、0nm波长下的OD值为0.81.0，记为OD，将肯定量菌液分别与三氯甲烷、乙酸乙酯和十六烷混匀振荡涡旋10、20、30、40、50s和60s，静置20min，待彻底分层后，测定水相的细菌浓度，重复3次，取平均值，记为OD，根据公式计算细胞疏水率。 细胞疏水率=x101% 1.7菌株自凝合率的测定 将肯定浓度的嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株菌液以3000rmin-1的转速离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤2次，然后悬垂于生理盐水中。调整菌液使之在600nm波长下OD值约为1.0，记为OD。将肯定量的菌悬液，分別在室温下静置1.2、3、4h和5h，然后各吸取1mL上层溶液测

8、得其OD值，重复3次，取平均值，记为OD，菌株自凝合率的计算公式见式。 菌株自凝合率=x101% 1.8菌株共凝合率的測定 将肯定浓度的嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株菌液分别与致病菌、腐败菌菌液以3000rmin-1的转速离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤2次，然后悬垂于生理盐水中，调整受试菌株菌液浓度，使其在600nm波长下的OD值约为0.4。将肯定量的菌悬液振荡涡旋3min后，37下静置2h，然后吸取1mL上层溶液测定OD值，重复3次，取平均值，菌株共凝合率的计算公式见式。 菌株共凝合率 =/2-OD混/2x101% 式中，ODg为嗜酸乳杆菌菌悬液在600nm处的O

9、D值;OD菌为致病菌菌悬液在600nm处的OD值;OD混为混合上层溶液在600nm处的OD值。 2结果与分析 2.1生长曲线分析 嗜酸乳杆菌的生长状况如图1所示。由图1可知，嗜酸乳杆菌的生长过程分为适应期、对数期、稳定期3个阶段。1.516h处于对数生长期，16h之后到达平台期。菌体在对数生长期末期及平台期初期活性最高，生长状况最稳定，因此，相宜用此阶段的菌株进行试验，本试验将选用培育18h的菌株进行试验。 2.2菌株的耐盐性 嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株的耐盐性如图2所示，菌株的OD值与盐浓度呈负相关。盐浓度在5.00%时，两者的OD值差距最大，说明此时嗜酸乳杆菌表层蛋白

10、对嗜酸乳杆菌耐盐性的影响最明显。从8.00%起先，嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株的OD值差距渐渐减小并趋于0。且亲本株的耐盐性高于去表层蛋白的处理菌株，由此可知，嗜酸乳杆菌的表层蛋白对提高菌株的耐盐性具有肯定的影响。 2.3菌株的耐胆盐性 嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株的耐胆盐性如图3所示，菌株的OD值与胆盐浓度呈负相关。胆盐浓度在0.4gL时，两者的OD值差距最大，即嗜酸乳杆菌的表层蛋白对嗜酸乳杆菌耐胆盐性影响最显著。当胆盐浓度达到0.8gL-1时，嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株的OD值差距渐渐减小并趋于0。且亲本株的耐盐性均高于去表层蛋

11、白处理的菌株，由此可知，嗜酸乳杆菌的表层蛋白在肯定程度能够提高菌株的耐胆盐性。 2.4菌株的表面疏水率 嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株的表面疏水率如图4所示。由图4可知，在涡旋初期，涡旋时间与疏水率呈正相关;30s后，涡旋时间与疏水率呈负相关，且涡旋时间越长，疏水作用越弱;对比发觉，亲本株的表面疏水率均高于经去表层蛋白处理的菌株，由此可知，嗜酸乳杆菌的表层蛋白对于提高嗜酸乳杆菌的表面疏水性具有主动作用。 2.5菌株的自凝合率 嗜酸乳杆菌菌株和经去表层蛋白处理的嗜酸乳杆菌菌株的自凝合率如图5所示。由图5可知，两种菌株的自凝合力和静置时间都呈正相关，亲本株的自凝合率高于经去表层蛋

12、白处理的菌株，随着静置时间的增加，两者差距增大。除此之外，菌液自凝合率的上升趋势并不是一条直线，初期上升较慢，后期上升较快，且亲本株的自凝合速度比经去表层蛋白处理的菌株快。由此可知，嗜酸乳杆菌的表层蛋白提高了菌株的自凝合力。 2.6菌株的共凝合率 嗜酸乳杆菌菌株与致病菌的共凝合率如图6所示。沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均是体内常见的致病菌，在人体肠道内的生长繁殖简单引起各项生理、病理反应。探讨发觉，粘附在肠道的乳杆菌可以通过竞争粘附位点或空间位阻、产生抑菌物质等抑制致病菌的粘附作用。由图6可知，亲本株与致病菌的共凝合率均高于经去表层蛋白处理的菌株，另外嗜酸乳杆菌的表层蛋白对不

13、同致病菌的影响程度不同，其中对沙门氏菌的影响最明显，而对副溶血弧菌的影响较小。由此可知，嗜酸乳杆菌的表层蛋白可促进致病菌聚集，可能会影响其对致病菌的抑制实力。 3探讨 双杰等在几种乳杆菌表层蛋白的探讨试验中发觉，嗜酸乳杆菌等可能具有表层蛋白，并且对提取方法进行了比较分析。李振梅等利用3种不同的表层蛋白提取方法，对嗜酸乳杆菌表层蛋白进行了提取和纯化。现如今越来越多的学者把探讨重点放在乳杆菌表层蛋白的结构与功能。 本试验结果表明，嗜酸乳杆菌亲本株的表面疏水率与自凝合率均高于经去表层蛋白处理的菌株，且具有表层蛋白的嗜酸乳杆菌的自凝合速率大于处理菌株，由此可见，表层蛋白能增加嗜酸乳杆菌菌株的表面疏水性

14、和自动聚集性，这与朱晓等的探讨成果一样。 李鹏成等探讨了乳酸菌表层蛋白在抵挡致病菌侵袭方面所发挥的作用，结果显示，嗜酸乳杆菌表层蛋白对肠道细胞具有爱护作用，可拮抗沙门氏杆菌的黏附。乳杆菌促进致病菌聚集的实力，可能会影响其对致病菌的抑制实力，分析该试验结果发觉，嗜酸乳杆菌亲本株的共凝合实力强于经去表层蛋白处理的菌株，嗜酸乳杆菌的表层蛋白对抑制致病菌的优势尽显无疑。 综上所述，嗜酸乳杆菌的表层蛋白可提高菌株的耐盐性、耐胆盐性、疏水性、自凝合力及共凝合力。因此，表层蛋白增加嗜酸乳杆菌的黏附性、抑制病原菌侵袭、提高菌株耐受性，对乳杆菌的益生功能具有重要作用。但是嗜酸乳杆菌表层蛋白种类繁多且结构困难，现

15、如今与之相关的探讨还非常有限，挖掘和探讨嗜酸乳杆菌表层蛋白的生理功能，从而平安高效的将乳杆菌及其表层蛋白应用于食品、药品德业。 参考文献： 1Ulla H，Airi P. Lactobacillus surfacelayer proteins： struc ture， function andapplicationsJ. Appl Microbiol Biotechnol，2022 ： 5225-5243. 2Jakava-Vil janen M，Palva A. Isolation ofsurface layer protein carrying Lactobacillusspecies f

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