干扰素-γ对乳腺癌细胞HLA-Ⅰ分子表达的影响.docx

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1、干扰素-对乳腺癌细胞HLA-分子表达的影响 打开文本图片集 摘要：目的 探讨干扰素-对乳腺癌细胞表面HLA-类分子表达的影响，并探讨其在乳腺癌治疗中的免疫作用机制。方法 培育乳腺癌SKBR3细胞株，依据IFN-浓度将其分为25 U/ml、50 U/ml、101 U/ml组，未加药组为空白比照组。通过实时荧光定量PCR和流式细胞术试验检测经不同浓度IFN-作用后的乳腺癌SKBR3细胞内HLA- mRNA的含量，以及表面的HLA-类抗原的表达。结果 实时荧光定量PCR结果显示，空白比照组、25 U/ml、50 U/ml、101 U/ml组HLA- mRNA的表达量分别为、，三个浓度组均较空白比照组

2、表达量高;流式细胞术结果显示，空白比照组、25 U/ml、50 U/ml、101 U/ml组细胞表面HLA-蛋白表达量为、，三个浓度组均高于比照组。结论 IFN-上调乳腺癌细胞HLA-类抗原的表达有利于抗乳腺癌作用。 关键词：干扰素-;乳腺癌;HLA;免疫治疗 中图分类号：R737.9 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1016-1959.2022.04.029 文章编号：1016-195904-0088-03 Abstract：Objective To investigate the effect of interferon- on the expression of H

3、LA class molecules on breast cancer cells and to explore its immune mechanism in the treatment of breast cancer. Methods Breast cancer SKBR3 cell line was cultured and divided into 25 U/ml，50 U/ml and 101 U/ml groups according to IFN- concentration. The untreated group was a blank control group. Rea

4、l-time quantitative PCR and flow cytometry were used to detect the content of HLA- mRNA and the expression of HLA- antigen on the surface of breast cancer SKBR3 cells treated with different concentrations of IFN-. Results The real-time PCR results showed that the expression levels of HLA- mRNA in th

5、e blank control group， 25 U/ml， 50 U/ml and 101 U/ml were ，the three concentration groups were higher than the blank control group ; the flow cytometry results showed that the blank control group， 25 U/ml， 50 U/ml The expression of HLA- protein in the cell surface of the 101 U/ml group was ， ， ， ， a

6、nd the three concentration groups were higher than the control group . Conclusion IFN- up-regulates the expression of HLA- antigen in breast cancer cells， which is beneficial to the anti-breast cancer. Key words：Interferon-;Breast cancer;HLA;Immunotherapy 乳腺癌是目前世界上第2大常見的恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第1位。发病率占成人恶性肿瘤的3

7、%，仅次于肺癌。2022年新增的乳腺癌病例超过200万例1。尽管乳腺癌的早期筛查、手术治疗、放化疗、内分泌治疗以及分子靶向治疗已取得重大进展，但乳腺癌仍旧是女性肿瘤死亡的重大疾病2。肿瘤免疫理论认为免疫逃逸机制在肿瘤的发生和发展过程中起着关键作用。近年来，免疫躲避已被公认为癌症进展的标记3。MHC-类分子表达缺陷是肿瘤免疫逃逸的重要机制。探讨发觉IFN-可以上调多种肿瘤细胞表面MHC-类分子的表达，有利于阻断肿瘤免疫逃逸。但对乳腺癌细胞表面MHC-类分子表达的作用有待进一步探讨。本探讨应用低表达HLA-I的乳腺癌细胞探究IFN-对其细胞表面HLA-类分子表达的上调。 1材料与方法 1.1药品与

8、试剂 DMEM细胞培育基、胰酶、PBS购买自美国Gibco公司和胎牛血清购买自以色列BI公司。IFN-购于美国peprotech公司;HLA-ABC抗体购于天津三箭生物公司;HLA-ABC以及GAPDH引物购自Invitrogen公司。SKBR3乳腺癌细胞为本试验室保存。 1.2试验方法 1.2.1细胞培育 将乳腺癌SKBR3细胞以DMEM完全培育基，置于5% 的CO2恒温恒湿培育箱中培育，待细胞密度达到90%左右时传代。弃去旧的细胞培育基，PBS漂洗细胞2次，3 ml 0.25%胰蛋白酶消化1.5 min，吸去胰酶，加入10%胎牛血清DMEM培育基3 ml吹打成单细胞悬液，将细胞悬液传至3个

9、新培育瓶中，加入5 ml10%胎牛血清DMEM完全培育基接着培育。 1.2.2荧光定量PCR 实时荧光定量PCR试验组分别加入终浓度为25 U/ml、50 U/ml、101 U/ml IFN-，未加药物组为空白比照组。用TRIzol抽提各组细胞总RNA。根据Thermo逆转录试剂盒说明书配置试验反应液，反转录反应参数为：421 h;735 min。qPCR循环参数为：95预变性10 s后，随后按6030 s，7320 s进行45个循环;试验以GAPDH基因内参表达水平为比照，以2-Ct法分析细胞中HLA-类分子的mRNA表达水平。扩增HLA-I基因引物：正向引物：5-GCTACTACAACCA

10、GAGCGAGG-3，反向引物：5-GTGTGATCTCCGCAGGGTAGA-3;扩增GAPDH基因引物：正向引物：5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，反向引物：5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。试验重复3次。 1.2.3流式细胞术检测细胞表面HLA-类分子 药物处理同荧光定量PCR。将各组细胞制成细胞悬液，用含1%胎牛血清的PBS漂洗3次。调整每组细胞浓度为1107个/ml。将每组细胞悬液分2管，每管 25 l，其中一管加HLA- FITC 单抗1.5 l。另一管加入同型比照1.5 l。室温避光反应 40 min。加入1%胎牛血清PBS 400l/管。采纳流式免

11、疫荧光法检测样品，每管样品分析5000个细胞。试验重复3次。 1.3统計学分析 全部数据采纳SPSS 21.0 统计学软件进行统计，计量资料采纳表示，行单因素方差分析，组间比较用Tukey检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1 IFN-对SKBR3乳腺癌细胞的HLA- mRNA水平的影响 实时荧光定量PCR结果显示IFN-处理组细胞 HLA- mRNA 表达量高于空白比照组，101 U/ml组最高。且HLA-mRNA 表达量随着IFN-浓度的增加而增加，表明这个浓度区间中，IFN-有诱导乳腺癌SKBR3细胞HLA-mRNA的作用，具有浓度依靠性，差异有统计学意义，见表1。

12、 2.2 IFN-对SKBR3乳腺癌细胞表面的HLA-蛋白表达的影响 流式细胞免疫荧光检测显示，经25、50、101 U/ml IFN-处理的SKBR3细胞表面的HLA-I的表达量高于空白比照组，差异具有统计学意义。且随着IFN-浓度的增高，细胞表面HLA-的表达量增高，具有浓度依靠性，见表2。 3探讨 免疫应答是指机体免疫系统对体内抗原进行识别，继而清除抗原的一系列生物 学效应过程。T细胞是人体细胞免疫的主要细胞之一，在抗肿瘤免疫机制中发挥着主导作用。肿瘤细胞表面免疫抗原的丢失是肿瘤细胞躲避机体免疫的主要缘由之一，在肿瘤的发生发展中起着关键作用。提高肿瘤表面的免疫抗原表达可增加肿瘤细胞的免疫

13、源性，同时提高T细胞对肿瘤细胞识别度，达到抗肿瘤的作用。HLA-参加人类免疫细胞识别肿瘤抗原，在多种人类肿瘤细胞中存在着HLA-抗原的缺失。吴明雨等4探讨发觉低分化型口腔鳞状细胞癌组织HLA-B表达较正常组织和高分化OSCC明显下调，可能与低分化型OSCC出现较高的淋巴道转移率相关，提示HLA-B的表达下调可能在OSCC淋巴道转移中有着重要意义。同时，HLA-B可作为一项监测口腔鳞状细胞癌恶性程度与淋巴道转移的指标。纪晓坤等5发觉在人卵巢癌SKOV3细胞转染Beclin1质粒后HLA-、HLA-表达量增加，使卵巢癌细胞免疫应答增加。Chang C等6报道大部分肿瘤中均存在 HLA-表达异样，并

14、在对101多种肿瘤性损伤的探讨中发觉16%80%的损伤均出现HLA-的表达缺失或下降。由此可见HLA-分子的表达对肿瘤的发生、发展有关键作用。近些年来兴起的肿瘤免疫疗法较传统治疗方法可显著提高患者的生存质量。目前对乳腺癌的免疫疗法的探讨相对较少。IFN-作为重要的自然免疫调整剂，可上调多种肿瘤细胞表面免疫分子的表达，从而增加免疫细胞的抗原提呈作用，使Th0细胞向Th1分化7。同时，IFN-还可刺激APCs细胞，上调IL-12、IL-27和CD86等的表达，促进了Th1细胞的分化和细胞毒性T淋巴细胞功能。此外，IFN-可干扰Th2，Th17、调整性T细胞等在肿瘤细胞免疫躲避过程中起关键作用的细胞

15、的分化8。李林卿等9在对273例乳腺癌手术患者的癌组织的检测中发觉其中有92例患者的乳腺癌组织中HLA-呈强阳性表达，而179 例表达下调;且HLA-的表达量与TNM分期早晚、有无淋巴结转移及血管侵扰均相关。HLA-表达下调者的无病生存率显著低于HLA-表达阳性者。说明HLA-分子的表达与乳腺癌的发生和进展有着重要的相关性。探讨表明IFN-可抑制多种肿瘤细胞系生长，而且对乳腺癌皮肤复发患者进行病灶内注射IFN-可使皮肤损伤部分或完全消退10。但是其抗肿瘤作用机制尚未完全清晰。据以往的探讨发觉11，12，IFN-可上调结肠癌细胞、胃癌细胞表面HLA-分子表达。但对乳腺癌细胞表面HLA-分子表达的

16、作用有待进一步探讨。 本探讨通过荧光定量PCR试验和流式细胞术检测视察到IFN-在体外对乳腺癌细胞株SKBR3的HLA-基因转录与空白比照组比较明显增加、细胞表面HLA-蛋白表达与空白比照组相比也明显增加，且上调强度与干扰素的浓度呈剂量依靠的关系。IFN-上调乳腺癌细胞的HLA-表达，可抑制肿瘤细胞的免疫躲避作用，增加免疫系统对肿瘤细胞的识别，从而起到抗乳腺癌的作用。本探讨为乳腺癌的免疫治疗供应了肯定的探讨基础，也为以后IFN-联合其他药物治疗乳腺癌供应了试验基础。总之，IFN-在乳腺癌治疗中的作用机制值得进一步深化探讨。 参考文献： 1Stewart B，Wild C.World Cance

17、r Report 2022：International agency for research on cancerM.Geneva：World Health Organization，2022. 2Siege RL，Miller KD，Jemaal A.Cancer statistics，2022J.CA Cancer J Clin，2022，65：5-29. 3卢伸，苏丹.免疫检查点阻断用于肿瘤治疗的探讨进展J.好用肿瘤杂志，2022，31：19-23. 4吴明雨，于大海，程立，等.HLA-B在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义J.微生物学免疫学进展，2022，46：35-39. 5纪晓坤，王学利

18、，王珩，等.Beclin1和HLA、在人卵巢癌SKOV3细胞中的表达J.临床与试验病理学杂志，2022，33：954-958. 6Chang C，Campoli M，Ferrone S.Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells： current challenges and future directionsJ.Adv Cancer Res，2022：189-234. 7Abiko K，Matsumura N，Hamanishi

19、J，et al.IFN-gamma from lymphocytes induces PD-L1 expression and promotes progression of ovarian cancerJ.Br J Cancer，2022，112：1501-1509. 8Zhang X，Zeng Y，Qu Q，et al.PD-L1 induced by IFN-gamma from tumor-associated macrophages via the JAK/STAT3 and PI3K/AKT signaling pathways promoted progression of lu

20、ng cancerJ.Int J Clin Oncol，2022，22：1026-1033. 9李林卿，莊文欣，李鹏程，等.HLA-在乳腺癌组织中的表达及其临床意义J.中国普外基础与临床杂志，2022，20：1132-1136. 10Kamali-Sarvestani E，Merat EA，Talei AR.Polymorphism in thegenes of alpha and beta tumor necrosis factorsand gamma interferonamong Ira-nianwomen with breast cancerJ.Cancer Lett，2022，223

21、：113-119. 11刘钢，黄文广，史火喜，等.结直肠癌人类白细胞抗原ABC表达与预后的相关性及干扰素的诱导作用探讨J.中华临床医师杂志，2022，3：1126-1134. 12Mimura K，Shiraishi K，Mueller A，et al.The MAPK pathway is a predominant regulator of HLA-A expression in esophageal and gastric cancerJ.J Immunol，2022：6261-6273. 收稿日期：2022-11-29;修回日期：2022-12-9 编辑/成森 第10页 共10页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页第 10 页 共 10 页