根癌农杆菌介导ACS反义基因转化香蕉的研究.docx

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1、根癌农杆菌介导ACS反义基因转化香蕉的研究 摘 要 以香蕉品种天宝蕉为试材，对以根癌农杆菌介导法的香蕉遗传转化体系进行较全面的探讨，并以该系统进行了ACS反义基因转化香蕉的探讨。结果表明：不经预培育的香蕉茎尖横切薄片，侵染前用附加0.1 mg/L甘露醇的高渗固体培育基前处理4 h，农杆菌重悬液浓度为OD600在1.0左右，重悬液中含101 g/L蔗糖，接菌时间为1015 min，于26 黑暗条件下共培育4 d，共培育培育基pH值为5.8是较为适合的转化条件；采纳附加101 mg/L卡那霉素、2 mg/L AgNO3筛选培育基对共培育后的香蕉横切薄片进行筛选，共获得5个转ACS反义基因的抗性芽系

2、；经GUS组织化学法及PCR检测，gus基因已整合进香蕉基因组。 关键词 香蕉；横切薄片；根癌农杆菌；ACS反义基因；转化 中图分类号 S668.1 文献标识码 A Transformation of Antisense ACS Gene to Banana Mediated by Agrobacterium tumefaciens HUANG Yuji， LAI Zhongxiong *， LIN Yuling， CHEN Yukun Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry Unive

3、rsity， Fuzhou， Fujian 350002， China Abstract A high efficiency and systematic transgenic procedure mediated by Agrobacterium was developed in Musa spp. cv. Tianbaojiao. The introduction of antisense ACS gene to banana was conducted，and the optimized parameters used in Agrobacterium-mediated transfor

4、mation were obtained. The best transient expression of GUS was obtained under the conditions as follows：the thin cross-sections which were not precultured but were pretreated with 0.1 mol/L mannitol for 4 h，and the Agrobacterium suspension was with OD600 value of 1.0 and supplemented with 101 g/L su

5、crose，the samples were infected for 1015 mins，and then they were transferred onto the non-selective mediumsupplemented with 0.1 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA for co-culture for 4 days at 26 in the dark. After co-culture，the thin cross-sections were selected on MS medium supplemented with 101 mg/L kanamyc

6、in and 2 mg/L AgNO3，which could be used to inhibit Agrobacterium contamination and be good for bud differentiation. At last，5 resistant bud lines were maintained for further studies. The GUS histochemical and PCR assays proved that the gus gene had integrated into the genome of the 5 resistant bud l

7、ines. Key words Banana； Thin-cross-section； Agrobacterium-mediated； Antisense ACS gene； Transformation doi 10.3969/j.issn.1010-2561.2022.01.004 在果实延熟保鲜上，广泛采纳的气调贮藏或运用保鲜剂等方法所能保鲜的时间特别有限，而且成本很高。ACS催化S-腺苷蛋氨酸向乙烯转化，是植物体内乙烯生物合成的关键酶。可通过反义RNA技术限制ACS基因表达抑制乙烯生物合成，提高果实耐贮性能。至今为止，在番茄1-4、烟草5、西瓜6、河套蜜瓜7、番木瓜8、梨9上都进行了该

8、基因的转化工作，探讨结果都表明，ACS反义基因的导入的确能不同程度的抑制乙烯的生成。香蕉为呼吸跃变型果树，若实现该基因的转化将具有重要意义。虽香蕉属单子叶植物，但随农杆菌侵染机理的深化探讨和揭示，采纳相应的技术措施，农杆菌介导的香蕉基因转化也取得了肯定进展。Gregory等10首先报道了通过农杆菌介导实现外源基因对香蕉的转化，随后探讨者们绽开了一系列相关探讨，Ganapathi11、Mo/ller-Nielsen12、陈廷速13、黄霞14和张妙霞15等进行了农杆菌介导的香蕉转化技术的探究和相关基因的转化探讨。本探讨拟采纳根癌农杆菌介导法将ACS反义基因导入香蕉，抑制乙烯的生物合成，有望培育出果

9、实耐贮运的新品种，从根本上解决香蕉采后贮藏保鲜问题。 1 材料与方法 1.1 材料 转化受体材料为天宝蕉低代试管苗茎尖横切薄片，由福建农林高校园艺植物生物工程探讨所所保存。同一组试验中外植体供体植株的培育代数和培育时间均相同。根癌农杆菌菌株为LBA4404，植物表达载体为pBI121，含有gus报告基因、卡那霉素抗性筛选基因和ACS反义基因，由中国农业高校李建生教授惠赠。 1.2 方法 1.2.1 转化 挑取农杆菌单菌落接种于含101 mg/L卡那霉素的YEB液体培育基，28 ，120 r/min振荡培育过夜，即活化菌液，将培育好的菌液在4 500 r/min下离心10 min，后用MS+10

10、1 g/L 蔗糖的液体培育基重悬菌体，然后将薄片外植体移入打算好的菌液中，在28 ，120 r/min条件下振荡数分钟，取出薄片后置于MS+1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA固体培育基上，于26 下共培育4 d。然后用头孢霉素无菌水除去薄片表面的农杆菌，后转移到筛选培育基MS+2.0 mg/L AgNO3+101 mg/L kan上进行抗性筛选，筛选2个月。 对于转化因素的探讨共设计了以下9组试验： 共培育时间； 农杆菌重悬液浓度； 农杆菌重悬液中蔗糖浓度； 农杆菌接菌时间； 外植体预培育； 外植体前处理； 共培育培育基pH值； 共培育温度； 薄片外植体的生理状态。 以上9组处理

11、中，除需试验的因素外其他转化条件均一样，且通过GUS瞬时表达状况确定本系统最适合的转化条件。 1.2.2 GUS组织化学法检测 香蕉茎尖薄片经农杆菌侵染，共培育4 d除菌后，取薄片于微量离心管中，加适量的X-Gluc工作液，置于37 黑暗条件下保温4 h，于显微镜下视察染色状况，每个处理各取30片，3个重复，统计出现蓝斑的薄片数，计算其一百零一分率。 1.2.3 抗性芽的筛选与继代增殖 香蕉横切薄片的筛选主要采纳干脆筛选法。30 黑暗条件下进行筛选培育，筛选2个月，每隔10 d左右将香蕉转移至相同配方的簇新筛选培育基上，同时剔除褐变死亡以及白化的小芽。将选择培育所获得的抗性芽转入分化培育基中进

12、行继代扩繁培育，以形成丛芽。各继代周期中培育条件保持一样，培育室温度限制在，光照强度为1 000 lx，光照时间为12 h/d。 1.2.4 生根培育 将扩繁得到的丛芽分成单芽，接种到含有选择压的生根培育基上进行生根培育。培育条件同上。 1.2.5 抗性再生幼苗的移栽 待抗性再生幼苗长至具有34片绽开的叶片并带有58条健壮的不定根时，打开瓶盖炼苗7 d。后将附着于根部的培育基用无菌水洗净，移栽于消毒过的泥炭土中。起先12周用罩子罩住幼株，防止水分蒸发，保持较高湿度，此后渐渐降低湿度与正常湿度条件一样，在温室中接着培育。 1.2.6 再生植株的GUS组织化学法检测 将香蕉再生植株的叶片剪下，放入

13、1.5 mL微量离心管中，然后加适量的X-Gluc工作液，置于37 黑暗条件下保温4 h；取出材料，用75%乙醇漂洗脱色，至阴性比照材料呈白色为止；于显微镜下视察染色状况。 1.2.7 gus基因的PCR检测 采纳CTAB法提取香蕉总DNA，gus基因引物由上海生工合成，引物引物序列为5-GCTATACGCCATTTGAAGCC-3和5-TTGACTGCCTCTTCGCTGTA-3。PCR扩增产物进行凝胶电泳检测。 2 结果与分析 2.1 GUS瞬时表达检测时间的选择 共培育时间对GUS瞬时表达率的影响见表1。由表1可看出，共培育2 d时瞬时表达率较低，当共培育34 d时瞬时表达率明显提高，随

14、后GUS活性渐渐衰退，到7 d时降为10.54%。3次重复试验的结果都显示共培育4 d时香蕉薄片的GUS瞬时表达活性最高，而未被侵染的比照薄片始终无GUS表达。因此，选择4 d为此转化试验的共培育时间。 2.2 农杆菌重悬液浓度对GUS瞬时表达的影响 农杆菌重悬液浓度对GUS瞬时表达率的影响见表2。由表2可看出，随着重悬液浓度的上升，瞬时表达率也上升；但当重悬液浓度超过到OD600在1.0后，瞬时表达率起先下降。可见，菌液浓度过高或过低，转化效率都有所下降。 2.3 农杆菌重悬液中蔗糖浓度对GUS瞬时表达的影响 农杆菌重悬液中蔗糖浓度对GUS瞬时表达率的影响见表3。表3列出了不同蔗糖浓度下，G

15、US瞬时表达状况。可以看出，当农杆菌重悬液中蔗糖浓度达101 g/L时，香蕉薄片的GUS基因瞬时表达最好，达41.90%。 2.4 农杆菌接种时间对GUS瞬时表达的影响 农杆菌介导植物转化时，必需将菌液与植物材料进行肯定时间的混合培育，使农杆菌接种到植物细胞表面，接菌时间的长短对转化效率的影响比较大。结果如表4所示，当接菌时间为1015 min时，GUS表达率较高；当超过30 min后，其表达率明显下降；接菌60 min时，其瞬时表达率只为9.18%。这可能是香蕉薄片外植体在菌液中浸泡时间过长而受到过大的毒害造成的。 2.5 外植体预培育对GUS瞬时表达的影响 一般认为外植体在转化前进行预培育

16、，不仅促进细胞分裂，而且利于伤口的酚类物质释放与积累、T-DNA转移并整合到植物细胞基因组，从而提高外源基因的瞬时表达和转化率。但本试验的结果却是不经预培育的薄片转化的瞬时表达率最高，预培育1 d的薄片瞬时表达率次之，预培育2 d的最低。 2.6 外植体前处理对GUS瞬时表达的影响 为进一步提高农杆菌侵染外植体的效率，进行了外植体的前处理试验，结果如表6所示，外植体于MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L BA+0.1 mol/L甘露醇高渗处理4 h后再接种农杆菌，其瞬时表达率最高，达40.05%。高渗处理使细胞失水，形成内高外低的渗透压梯度，有利于植物细胞在极短的时间内汲取其四周的

17、农杆菌悬浊液，从而提高转化率。 2.7 共培育培育基pH值对GUS瞬时表达的影响 一般认为偏酸性的培育条件有利于农杆菌vir基因的表达，但也有人认为pH7.0有利于转化，缘由是适合农杆菌的pH值为7.0，可缩短共培育时间，减轻农杆菌对材料的毒害，从而有利于材料的复原生长。本探讨的结果是，在pH7.0时，瞬时表达率较低，而且pH7.0也不适合植物生长。同时，从表7可以看出，pH5.8时瞬时表达率最高。因此，确定pH5.8为本系统的适合pH值。 2.8 共培育温度对GUS瞬时表达的影响 由试验结果可知，在香蕉的转化中，共培育温度在26 时，GUS瞬时表达率最高，在24 时差异不大，其余几个温度的G

18、US瞬时表达率都明显低于24和26 。说明共培育温度对香蕉的转化有肯定影响的，26 是本试验发觉的香蕉转化最佳的共培育温度。 2.9 薄片外植体的生理状态对GUS瞬时表达的影响 外植体的生理状态是转化试验能否胜利的关键所在。由表9可看出，外植体越靠近根部，其瞬时表达率也越高。编号为1的外植体，转化时瞬时表达率最高，可达46.66%；另外，优化受体系统试验结果也表明香蕉茎尖顶端分生组织出芽率最高。因此选择香蕉的顶端分生组织横切薄片作为本探讨中农杆菌侵染的干脆受体。 2.10 香蕉抗性芽筛选状况 将农杆菌感染过的香蕉横切薄片接到筛选培育基上，筛选2个月。随着筛选的进行，大部分的抗性芽生长正常；而一

19、些白化的抗性芽生长到肯定阶段就渐渐黄化，后停止生长至最终死亡；还有一些抗性芽长出的叶片无法转绿，成为黄化体。经过筛选，最终分别获得5个转ACS反义基因的抗性芽，抗性芽分化率为22.01%。 2.11 香蕉转基因植株再生 抗性芽转移到含有抗生素的生根培育基，1周后起先长根，3周后长成完整的健壮植株。大部分植株形态与未转化的香蕉植株无异，有少数嵌合体植株，即叶片不是呈正常的绿色，在同一植株中，部分叶片呈黄绿色，部分叶片呈绿色；在同一片叶子中也会出现黄绿相间的颜色。 2.12 香蕉转基因植株的移栽 生根后的植株经炼苗后移栽于消毒好的泥炭土中，移栽成活率可达90%以上，长势良好，如图1中F所示。 2.

20、13 转基因再生植株组织化学法检测 香蕉抗性芽再生植株的叶片，进行组织化学法染色，结果显示，香蕉抗性芽中的表达GUS的阳性克隆得到的再生植株的叶片切口被染成蓝色，叶片在X-Gluc工作液中浸泡过夜之后颜色变成浅黄绿色，有的叶片中有蓝斑出现；有的叶片只有横切面上被染成蓝色，叶片内部未发觉染色。综上所述，可以初步确定这些再生植株为转基因植株。 经X-Gluc溶液染色检验为非阳性的抗性芽产生的再生植株的叶片再进行X-Gluc溶液染色仍未发觉有蓝斑出现，说明这些抗性芽中的确没有GUS表达。 2.14 转基因再生植株叶片gus基因PCR检测 对转化ACS反义基因的香蕉抗性芽再生的5 个株系叶片的gus基

21、因的PCR检测结果显示，未转化植株没有条带出现，质粒DNA和5个转基因再生株系都有明显可见条带。可见，gus基因已经整合进香蕉基因组中。 3 探讨与结论 随着农杆菌侵染机理的深化探讨，农杆菌介导禾谷类等单子叶植物基因转化已获得胜利。虽然与双子叶植物相比，农杆菌介导的单子叶植物的遗传转化仍存在着相当大差距，但只要建立高效的转基因受体系统、选择合适的菌株、采纳相适应的转化条件，是可以获得较高的转化效率的。而酚类化合物如乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮等被证明是vir基因的自然诱导剂。香蕉是单子叶植物，在农杆菌介导的香蕉遗传转化探讨中也有采纳AS等来提高转化效率的相关报道11，13，16。但本试验并未采纳

22、AS作为vir基因的诱导剂，香蕉薄片的GUS瞬时仍旧较高，最高可达46.66%。这可能是不同果树或同一果树不同基因型，或者是不同添加方式、不同的培育基成分对AS的敏感程度不同造成的。故笔者认为AS在香蕉转化中并不是必需的。 驾驭合适的菌液接种浓度及外植体在菌液中浸泡的时间，有助于提高转化效率并兼顾到后续的除菌。菌液浓度太低或浸泡时间太短，接种到伤口面的农杆菌数量太少，在共培育时转化效率低；菌液浓度过高或浸泡时间过长，常导致农杆菌繁殖过度，受体材料因毒害缺氧而软腐，降低转化效率，而且农杆菌和植物细胞的结合位点是有限的，当农杆菌浓度过大时，由于竞争激烈，反而不利于农杆菌与植物细胞的结合，从而也降低

23、了转化效率。 共培育时间对转化效率也有很大影响，不同转化材料或不同菌株类型所需的最佳共培育时间不同。共培育时间过短，农杆菌尚未附着，T-DNA还没有充分切割、转移和整合；时间过长，植物细胞易受毒害，后续培育时难以除菌，农杆菌简单过度生长。对于共培育温度这一因素，存在着25 17、22 18甚至20 19不一样的探讨结果。而本试验通过GUS瞬时检测认为，26 是农杆菌转化香蕉的适合温度。这其中可能涉及到T-DNA转移的最适温度，vir基因的诱导和外源片段整合及稳定表达须要的温度，以及植物细胞也可能存在着接受农杆菌转化的最适温度等，这些都须要从更深层次的作用机理方面进一步探究。 本探讨得到的转化体

24、中除了正常的转化体外，还存在白化和黄化现象，以及嵌合体现象。这些异样现象出现的缘由可能是农杆菌T-DNA整合进植物基因组时造成编码叶绿素的基因突变或缺失，致使植物细胞叶绿素合成受阻或叶绿体异样。 参考文献 1 汤福强， 刘 愚. ACC合成酶基因及其反义基因转化番茄获得转基因植株J. 科学通报， 11014， 39： 2 280-2 283. 2 罗云波， 生吉萍， 申 琳. 番茄中反义ACC合成酶基因的导入与乙烯生物合成的限制J. 农业生物技术学报， 11015， 3： 38-44. 3 刘传银， 田颖川.番茄ACC合成酶cDNA克隆及其对果实成熟的反义抑制J. 生物工程学报， 19101，

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