赣南地区非综合征性唇腭裂患者血浆代谢组学研究.docx

《赣南地区非综合征性唇腭裂患者血浆代谢组学研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《赣南地区非综合征性唇腭裂患者血浆代谢组学研究.docx（13页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、赣南地区非综合征性唇腭裂患者血浆代谢组学研究 摘要 目的 通过检测赣南地区非综合性唇腭裂患者与正常人血浆内源性代谢产物的改变，探讨基于核磁共振的代谢组学方法在临床实践中的可行性。 方法 分别收集17例NSCL/P患者和16例正常人比照组的血浆样品，测定NSCL/P患者血浆的一维1H-NMR图谱，采纳主成分分析法分析NMR数据，以鉴别NSCL/P组和正常比照组血浆中内源血浆代谢产物的改变，获得NSCL/P患者的特征代谢物。 结果 NSCL/P组和正常比照组间的血浆代谢产物存在明显差别。与正常比照组相比，NSCL/P患者血浆中的缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量上升；NSCL/P患者血浆中的丙氨酸、胆

2、碱、磷酰胆碱等代谢物的含量降低。 结论 采纳基于NMR的代谢组学技术能较好地反映赣南地区NSCL/P患者血浆的代谢改变，通过1H-NMR代谢图谱获得NSCL/P的特征代谢物，可以初步探讨NSCL/P的代谢机制，表明白该技术在临床应用中具有很大的潜能。 关键词 代谢组学；非综合征性唇腭裂；主成分分析；血浆 中图分类号 R782.2 文献标识码 B 文章编号 1673-1010136-0059-04 Preliminary investigation on plasma of non-syndromic NSCL/P using NMR-based metabonomics in southern

3、 Jiangxi LING Yongchang1 LIU Ruizhen2 LIU Xiang1 ZHANG Ying1 LI Niansheng1 1.Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341010， China； 2.Laboratory of Anatomy， Gannan Medical College， Ganzhou 341010， China Abstract Objective To study the metabolic cha

4、nges in plasma of non-syndromic cleft lip and/or palate patients in southern Jiangxi and to explore the feasibility of employing nuclear magnetic resonance -based metabonomics in clinical practice. Methods Plasma samples were collected from 17 NSCL/P patients and 16 healthy controls. 1-dimensional 1

5、H-NMR spectroscopy and principal component analysis was performed to analyze plasma metabolomic profile. Discriminating metabolites were identified and the metabonomic difference in plasma was examined between NSCL/P patients and the control group. Results The plasma metabolic profiling in NSCL/P pa

6、tients was clearly distinct from that of healthy controls. Compared with the control group， valine， phenylalanine and tyrosine were higher in plasma of NSCLP patients， while the levels of metabolites in plasma such as alanine， choline and phosphocholine were lower. Conclusion NMR-based metabonomics

7、approach could clearly reflect the metabolic changes of plasma in NSCL/P patients. Our study clearly demonstrated the great potential of the NMR-based metabonomics approach in elucidating the NSCL/P plasma metabolism and the feasibility of application in clinic diagnosis. Key words Metabonomics； NSC

8、L/P； PCA； Plasma 唇腭裂是常见的颌面发育畸形，其中非综合征性唇腭裂是常见的先天性畸形，它是指不伴发其他系统器官畸形，不在综合症之内唇裂合并腭裂，是一种多基因易感性疾病，有困难的遗传特点1，2，在致畸因素的影响下可能于胚胎发育的412周发生，环境因素也是此症发生的重要缘由。包括孕早期吸烟、饮酒、药物、养分缺乏、病毒感染、高热3，4。治疗过程有一点难度，且周期较长5。 代谢组学作为新近发展起来的一门学科，是指对由于生理病理刺激而引起的生物体代谢产物的动态改变同时进行定性和定量分析的一门科学。主要是通过检测生物体液和组织的NMR图谱，对生命系统内小分子代谢物进行定量分析，通过模式识别

9、和多元统计分析的方法进行系统测量、分析，将代谢物与生理病理刺激下的相关生物学事务联系起来，以确定改变发生的作用靶点，进而确定相关的特征生物标记物6，7。迄今，代谢组学探讨中常用的分析工具是NMR，尤其是1H-NMR8，9。 本探讨旨在运用代谢组学技术检测唇腭裂患者血浆，探讨比较先天性唇腭裂患者和正常人的血浆代谢状况，找出两者间的差异，初步探讨唇腭裂患者血浆代谢的可能机制，从而为将来唇腭裂患者的早期诊断供应潜在的检测代谢物。 1 材料与方法 1.1试验仪器 本试验运用的主要仪器有：Bruker Avance DRX 600核磁共振仪；XYJ80-2低速离心机；MR1812高速离心机；4 mL肝素

10、钠抗凝管；F6-1冷冻干燥机。 1.2血浆样本的采集 随机实行2022年7月2022年7月在我院口腔科诊断为非综合征性唇腭裂患者的血浆。诊断为非综合征性唇腭裂的患者无单基因引起面裂的家族史，无相关致畸因子接触史，不伴发其他畸形且身体发育正常10。其中单纯性腭裂患者8例，唇裂并发腭裂患者9例；女12例，男5例；年龄618岁，平均岁。并随机选择2022年在赣南医学院第一附属医院健康体检科查体的健康人17例作为正常比照组，女12例，男5例；年龄720岁，平均岁。 1.3 探讨方法 1.3.1 样本的采集及处理 血液样本采集前，要求探讨对象空腹6 h以上。一次性静脉采血器抽取4 mL血液注入肝素钠抗凝

11、管中，室温下1500 r/min离心15 min，然后取上清液2 mL放入去酶的EP管内，在涡旋混匀器上快速混匀1 min后于4、14000 r/min离心15 min。吸取二次离心后的上清液1.5 mL放入干净的EP管内，并马上放入20低温冰箱中保存备用。 1.3.2 NMR数据的采集 预处理样本：冷冻血清室温下解冻，离心后取上层血清200 L加至5 mm的核磁管中，加入300 L的重水，振荡混匀。获得1H-NMR谱图：运用Varian 600 MHz 谱仪进行NMR 试验，1H-NMR共振频率为5101.93 MHz。横向弛豫加权试验采纳水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-

12、Gill序列，弛豫延迟2.0 s，采集时间为1.5 s，谱宽12000.0 Hz，温度25，总回波时间101 ms，累计次数64次。对全部一维1H-NMR谱在Topspin软件上进行相位和基线矫正后，用-葡萄糖在低场处的双峰定标。用AMIX软件对定标后的谱图在0.509.50 ppm的区域分段积分，积分区间宽为0.002 ppm。为了消退残余水峰、尿素峰以及外源信号的影响，去掉6.884.21 ppm 一段包含残余的水峰和尿素峰。之后，对核磁谱图进行总面积归一化处理。将数据导入SIMCA-P+软件包进行多变量分析。PCA、PLS-DA和OPLS-DA均取第一和其次两个主成分，均用得分图表示。P

13、CA结果主要视察样品整体的聚类状况以及是否存在离群点。PLS-DA和OPLS-DA采纳UV方式进行标准化处理，并运用交叉验证和排列试验对模型牢靠性进行验证。对通过验证的模型，用相关系数负载图表示出有贡献的物质及其贡献的大小，颜色越暖贡献越大。通过皮尔逊相关系数的显著性差异检测判定具有显著性变化的代谢物，进而对这些物质进行生物学解释。 2 结果 2.1 NSCL/P患者与正常人血浆1H-NMR代谢图谱比较 将正常比照组和NSCL/P组尿液1H-NMR指纹图谱放大6倍并进行叠加比较。波谱显示了两组样品在的化学位移处存在差异波峰。关键词：1，lipid脂质；2，valine缬氨酸；3，leucine

14、亮氨酸；4，isoleucine异亮氨酸；5，3-hydroxybutyrate羟基丁酸；6，lactate乳酸；7，alanine丙氨酸；8，lysine赖氨酸；9，acetate醋酸；11，glutamate谷氨酸；12，pyruvate丙酮酸；13，succinate琥珀酸；14，citrate柠檬酸； 15，malate苹果酸；16，trimethylae三甲胺盐酸盐；17，dimethylglycine二甲基甘氨酸；18，creatine肌酸；19，choline胆碱；20，phosphorylcholine磷酸胆碱；21，glycerophosphocholine甘油磷酰胆碱；22

15、，trimethylamine-N-oxide 氧化三甲胺；23，-glucose葡萄糖；24，-glucose右旋糖；25，scyllo-inositol青蟹肌醇；26，glycine甘氨酸；27 urea尿素；28，histidine组氨酸；29，tyrosine酪氨酸30，phenylalanine苯丙氨酸31，formate甲酸盐，见图1。 2.2 PCA分析 为了分析各个样品之间的关系，将校正后的数据做PCA分析。PCA是可以将分散在一组变量上的代谢图谱信息集中到某几个综合指标上的统计分析方法，利用主成分分析机体代谢的改变特征。采纳SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行模式识别多变

16、量分析，PCA采纳中心化换算的数据标度换算方式。见封三图1。 2.3 PLS-DA分析 利用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行偏最小二乘法发觉NMR 数据和其他变量之间的相关联系。偏最小二乘法-判别分析运用自适换算的数据标度换算方式。同时用交叉验证后得到的R2X 和Q2评判模型的有效性。然后，通过排列试验随机多次变更分类变量y 的排列依次得到相应不同的随机Q2值进一步检验模型的有效性。见封三图2。说明以模型的可说明指标R2X 和可预料指标Q2，结合排列试验检验结果共同显示，血清样本的NSCLP组和Control组所建立的模型成立。从得分图可以看出，两组数据虽然没有截然分开，但有各自的类聚

17、关系，可以将两者区分开来，说明NSCLP组样本的代谢组出现显著性差异。 2.4 OPLS-DA分析 正交矫正处理PLS-DA 模型，运用SIMCA-P+软件进行正交偏最小二乘法-判别分析，最大化地凸显模型内部不同组别间的差异。OPLS-DA 同时运用自适换算的数据标度换算方式。见封三图3。 2.5组间血浆差异代谢物统计 通过对OPLS-DA 的分析，分析不同组间血浆各代谢物相应的相关系数，进一步归纳有统计学意义的代谢物。在相关系数图中，将每一个变量的loading 值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对，统计引起组间差异的代谢物。与正常比照组相比

18、，NSCL/P患者血浆中的缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量上升；从表1可知，NSCL/P患者血浆中的丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱等代谢物的含量降低。 表1 两组血浆中代谢物的NMR数据的OPLS-DA系数 3 探讨 先天性唇腭裂严峻危害着口腔颌面器官的形态及功能，不仅影响诞生人口素养，亦给患者及相关家庭造成身心负担。该疾病从遗传学上可分为综合征性唇腭裂与非综合征性唇腭裂两种，其中更为多见的是非综合征性唇腭裂。而非综合征性唇腭裂的发病缘由极其困难，有探讨表明可能与遗传和环境因素11-13亲密相关，但截至目前为止，尚未找到明确的干脆发病因素。 一般来说，人体血浆1H-NMR指纹图谱中的共振汲取峰所对应的化

19、合物与人体血浆中所含生物有机成分是相同的，但是不同疾病患者血液中生物有机分子由于病变会发生不同程度的变更，从而引起不同疾病的患者和正常人的血浆中所含的生物有机分子在某种程度上的不同，反映在1H-NMR上也是有所不同的。 本探讨运用代谢组学14对比分析了17例非综合征性唇腭裂患者和17例正常人的血浆样本，测定两者的1H-NMR 图谱，将正常人比照组和NSCL/P病患组尿液1H-NMR指纹图谱放大6倍并进行叠加比较。波谱显示了两组样品在的化学位移处存在差异波峰。接下来通过对OPLS-DA的分析，分析不同组间血浆各代谢物相应的相关系数，统计引起组间差异的代谢物。结果表明，非综合征性唇腭裂患者和正常人

20、比照组间的血浆代谢产物存在明显差异，这种差异主要是因为某些氨基酸与胆碱存在异样代谢。如非综合征性唇腭裂患者血浆中的缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的含量较正常人有所上升。其中，缬氨酸和苯丙氨酸都为必需氨基酸，缬氨酸通过作用于乳腺、黄体及卵巢，来维持神经系统功能的正常运行。苯丙氨酸的主要作用是确保中枢神经系统运作正常。同时与正常健康人相比，非综合性唇腭裂患者血浆中的丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱等代谢物的含量降低。丙氨酸虽为非必需氨基酸，但是起着重要作用。可以帮助身体将葡萄糖转变为能量，同时还可以帮助肝脏处理和清除体内各种不同毒素。这些功能便于给身体供应养料。此外，它还有助于保持血液中葡萄糖的健康水平。胆碱是一

21、种强有机碱，是卵磷脂的组成成分，也存在于神经鞘磷脂之中，是机体可变甲基的一个来源而作用于合成甲基的产物，同时又是乙酰胆碱的前体。能够促进脑发育和提高记忆实力，介导信息传递，调控细胞凋亡。这些代谢物的异样，会引起一些相关疾病的发生。 本探讨表明，运用代谢组学技术可以早期筛查某种疾病并探讨其代谢机制，从而有可能推想其潜在的发病缘由，从而为以后的临床应用供应理论支持。但我们目前的探讨仅仅限于技术层面的一些探究，初步得到一些结果。在接下来的探讨中，我们打算拓展试验：扩大样本量，使其更具有统计学意义；监控患者12 h前摄入食物的种类、数量等，尽量削减试验误差15。由于目前的探讨趋势是将代谢组学与基因组学

22、、转录组学和蛋白质组学技术16整合起来，因为基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学分别在基因、转录、蛋白质和代谢产物水平上检测和鉴别各种分子并探讨其生物学功能17。在将来的探讨中，我们将会从多方面、多角度的深化进行非综合征性唇腭裂患者的血浆探讨。 参考文献 1 代礼，缪蕾，周光萱，等. 110162000年中国围产儿腭裂畸形发生状况分析J. 华西口腔医学杂志，2004，11：35-37. 2 王丽君，黄金龙，万伟东. 非综合征性唇腭裂的遗传因素和环境因素探讨进展J. 国外医学遗传学分册，2022， 28：102-104. 3 陈曼丽，凌彬，林兆全. 非综合征性唇腭裂基因探讨进展J. 中华老年

23、口腔医学杂志，2022，7：188-191. 4 宋丛笑，张严. 唇腭裂发生因素分析J. 中国临床康复，2003，7：2495. 5 李攻非，柳春明. 唇腭裂患者上颌骨矫形治疗J. 口腔颌面修复学杂志，2001，2：58-60. 6 Nicholson J K，Lindon J C，Holmes E. Metabonomics：Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biologic

24、al NMR spectroscopic dataJ. Xenobiotica，11019，29：1181-1189. 7 Lindon J C，Nicholson J K，Holmes E，et al. Contemporary issues in toxicology the role of metabonomics in toxicology and its evaluation by the COMET projectJ. Toxicol Appl Pharmacol，2003，187：137-146. 8 杨军，宋硕林，Jose Castro Perez，等. 代谢组学及其应用J.生

25、物工程学报，2022，25：1-5. 9 陈雅竹，刘建国，白国辉，等. 代谢组学在口腔医学探讨中的应用进展J. 中华临床医师杂志，2022，7：6646-6649. 10 石冰. 唇腭裂修复外科学M. 成都：四川高校出版社，2004：35. 11 唐坤伦，马瑞，张健. 96例非综合征性唇腭裂发病因素的统计学分析J. 口腔颌面修复学杂志，2022，14：179-182. 12 丁艳，刘长云，王永芹，等. 非综合征性唇腭裂高危因素的条件Logistic回来分析J. 中华妇幼临床医学杂志，2022，4：533-536. 13 何苇，宋庆高. 造成唇腭裂发病相关因素分析J. 口腔颌面外科杂志，2022

26、，17：259-261. 14 洪毅，谈冶雄，王红阳. 代谢组学肿瘤学探讨的重要技术平台J. 中国肿瘤生物治疗杂志，2022，14：585-588. 15 宋具昆，周京琳，罗洪，等. 非综合征性唇腭裂患者血浆代谢组学的初步探讨J. 华西口腔医学杂志，2022， 27：147-149. 16 Kitano H. Systems biology：a brief overviewJ. Science，2002，295：1662-1664. 17 German J B，Bauman D E，Burrin D G，et al. Metabolomics in the opening decade of the 21st century：Building the roads to individualized healthJ. J Nutr，2004，134：2739-2732. 第13页 共13页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页第 13 页 共 13 页