草鱼养殖池噬菌蛭弧菌的分离与鉴定.docx

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1、草鱼养殖池噬菌蛭弧菌的分离与鉴定 摘要：利用双层平板法，以嗜水气胞菌为宿主菌，从草鱼养殖池水中分别蛭弧菌一株；依据蛭弧菌hit基因序列设计引物进行PCR扩增，所得产物经胶回收、测序比对，发觉其序列与噬菌蛭弧菌的hit基因101%同源，表明本探讨所分别得到的为噬菌蛭弧菌。 关键词：蛭弧菌；噬菌蛭弧菌；分别；鉴定；PCR 噬菌蛭弧菌，是一类由Stolp和Petzold于1962年首次发觉的、原核生物界唯一一类周质型专性捕食性细菌。其体形小，在土壤、淡海水、污水等不同环境中分布广泛，且运动活泼，具有“寄生”和“裂解”宿主菌的生物学特性。 养殖概论 近年来，随着集约化水产养殖业的进一步发展，以及养殖水

2、体的污染，嗜水气单胞菌等革兰氏阴性病原菌对草鱼等水产养殖动物造成了严峻的危害。蛭弧菌能寄生和裂解大多数种类的革兰阴性菌。鉴于这一特性，噬菌蛭弧菌受到了国内外学者的广泛关注，渐渐成为水产养殖业中一种良好的微生态制剂，在农业、工业和医学等不同领域均显示出了广袤的应用前景。 本探讨利用双层平板法从草鱼养殖池水中分别得到蛭弧菌一株，依据噬菌斑形成等对其进行初步的鉴定，同时依据蛭弧菌的host interaction基因序列设计了特异性引物，从分子水平上对该菌株进行了鉴定，确定该菌为噬菌蛭弧菌。为该菌应用于水产养殖疾病防治等理论探讨与实践应用供应了基础资料。 材料与方法 水样 采自绍兴皋埠镇某草鱼养殖池

3、，用采水器从底部取水，装于50mL灭菌的离心管中。 宿主菌株 以本试验室分别自患病草鱼并保存的嗜水气单胞菌为宿主菌。 培育基 双层培育基：上层为0.6%自来水琼脂，用于蛭弧菌筛选、分别和纯化；下层为1.5%自来水琼脂；一般养分肉汤培育基；浸出液：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠15g，蒸馏水加至1010mL，pH7.0。 主要试剂 Taq酶、dNTPs购自上海生工产品；DNA回收试剂盒购自爱思进；pGMT载体、大肠杆菌感受态等均购自天根公司；其他为国产分析纯。 噬菌蛭弧菌的分别与鉴定 第一，宿主菌悬液的制备。将宿主菌嗜水气单胞菌接种于NB平板上，30过夜培育，刮取、无菌水洗脱细菌并收集于5mL

4、离心管中，10100g，室温离心2min，去上清液，加入3mL无菌水制备成悬液，4保存备用。 其次，蛭弧菌的分别与纯化。样品处理：取池水，经八叠纱布过滤，将澄清液置超速冷冻离心机中离心；沉淀用5mL无菌水溶解，再经0.22m滤膜过滤后备用；蛭弧菌的分别、纯化：取1mL滤液加入2mL的宿主菌悬液，混匀；然后加入7mL灭菌并保持在48左右的0.6%自来水琼脂培育基，摇匀后倒至经灭菌的1.5%自来水琼脂固体培育基上。30下倒置培育，视察噬菌斑的形成；经2至4d的培育后，挖取平板上透亮、圆形和整齐的单个噬菌斑，置于NB液体培育基的离心管中，浸泡10min以上；用浸出液做双层平板，重复传代3次以上获得纯

5、化的蛭弧菌。 第三，蛭弧菌的PCR鉴定。在结合以上噬菌斑进行鉴定的基础上，依据相关学问及GenBank中蛭弧菌host interaction基因的序列，利用Oligo 6.5软件设计了特异性引物：BDhitf：5-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3，BDhitr：5-ACGACTGTGAACGGCAACG-3。PCR扩增体系为：DNA模板2.0L，Taq酶0.2L，dNTPs 0.4L，10PCR缓冲液2.5L，引物各1.0L，水17.9L。循环参数为：95预变性4min；94变性40sec，56退火25sec，73延长1min，35个循环；73再延长10min。琼脂糖凝胶电泳检查

6、扩增结果，PCR产物经割胶回收后，与T载体连接并转化大肠杆菌DH5感受态细胞；阳性克隆经鉴定后送上海生工测序，用blast和ClustalW2软件进行序列比对分析。 结果与分析 蛭弧菌的分别结果 采纳双层琼脂平板法，以嗜水气单胞菌为宿主菌，通过滤膜过滤的方法收集草鱼养殖池水池培育蛭弧菌。结果发觉，从第2d起起先形成大小相像、直径约0.1至0.25cm的圆形、透亮、边缘整齐、凹陷的噬菌斑“负菌落”；3d后出斑率较高，直至7d左右，其大小总体上随培育时间延长而增大，显示所分别的蛭弧菌具有明显的噬菌作用。选择特征典型的噬菌斑进行传代，经4次传代后得到蛭弧菌一株，记为BD-sx1。 蛭弧菌的PCR鉴定

7、 在利用噬菌斑等形态学指标和噬菌特性对本探讨过分别到的蛭弧菌进行初步视察与鉴定的基础上，本探讨依据文献报道及GenBank中蛭弧菌host interaction基因的序列设计了特异性引物，以宿主嗜水气单胞菌和大肠杆菌DH5为阴性比照，进行了PCR扩增反应。结果显示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中获得了近800 bp的扩增条带，大小与预期相符。进而，本探讨对PCR擴增产物进行了割胶回收，纯化产物与T载体连接后，转化感受态大肠杆菌DH5感受态细胞，对经鉴定后的阳性克隆进行测序，测序结果blast和Clustal W2软件与GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列进行比对了分析。比对结果表明，所得

8、基因序列与噬菌蛭弧菌的hit基因序列101%相像，进一步证明本探讨所分别、纯化到的蛭弧菌菌株BD-sx1为噬菌蛭弧菌。 探讨 培育基及其浓度 培育基的养分成分与宿主菌、蛭弧菌以及其他杂菌的生长亲密相关。Stolp等在1963年就提出经稀释的低养分培育基不利于宿主菌的生长而有利于蛭弧菌的生长。因此，在分别、纯化蛭弧菌时应运用低养分成分的培育基。Staples等比较了不同浓度稀释度的培育基从水样中分别蛭弧菌的效果，结果发觉高度稀释的培育基分别效果最佳。司稚东等探讨发觉，在1/10胨肉膏和酵母膏培育基上可形成蛭弧菌噬菌斑，但同时杂菌生长更快、菌落多，蛭弧菌噬菌斑易被其遮盖；而2%的自来水琼脂培育基上

9、杂菌少、噬菌斑明显、清楚，更适于分别蛭弧菌。本探讨分别纯化结果也显示，用低养分成分的自来水琼脂培育基分别蛭弧菌效果较好；同时，与司稚东等相比，琼脂运用浓度更低，仅用1.5%的琼脂也可取得良好分别效果。 双层琼脂平板法是蛭弧菌分别的经典方法，但在运用该方法时应留意上层培育基的温度应当限制在45-48左右，同时驾驭好倒平板的时机。温度过高，宿主菌和水样中待分别的蛭弧菌可能会被烫死；温度过低，上层培育基易凝固，简单导致倒出的平板不平整，宿主菌和蛭弧菌难以匀称分布，最终导致噬菌不清楚，影响分别效果。 蛭弧菌的鉴定 传统的蛭弧菌的鉴定可依据噬菌斑形态、革兰氏染色、接触酶抑制、寄生性、菌体形态的显微视察等

10、方法来进行，但上述方法存在特异性差、易受宿主菌干扰、有些较为繁琐等缺点，且简单产生误判。而本探讨依据蛭弧菌hit基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，并结合测序比对和生物信息学鉴定，具有快速、精确等优点，与传统的噬菌斑形态视察、寄生性、革兰氏染色、显微镜视察等相结合，可从不同角度、不同层次进行蛭弧菌的鉴定，利用分子鉴定提高精确性，以更好地满意理论探讨与实践应用的须要。 蛭弧菌微生態制剂在草鱼等水产养殖业中的应用前景 草鱼是我国的大宗鱼类、当家品种之一，但草鱼等“四大家鱼”的病害频发。传统的抗生素和化学药物治疗已难以适应国内外消费者对绿色无公害水产品质量平安的要求，因此，发展蛭弧菌等微生态制剂是

11、符合可持续发展和环境要求的重要发展方向。鉴于蛭弧菌株独特的“寄生”和“裂解”病原菌的生物学特性，作为一种益生菌，蛭弧菌微生态制剂取代抗生素药物用于草鱼等水产养殖业具有独特的优势和广袤的发展前景。 参考文献 1Stolp H，and Petzold H.Undersuchungen ubereigen obligat parasitischen Mikroorganismus mit lytischer Aktivitat fur Pseudomonas-bacterienJ.Phytopathol Z，1962，45：364-390 2Stolp H，and Starr MP. Bdellov

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