麻类脱胶菌的木糖发酵性能改造及初步检验.docx

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1、麻类脱胶菌的木糖发酵性能改造及初步检验 农业科学院麻类探讨所选育的菌株。酮酸脱羧酶基因PDC和乙醇脱氢酶基因AdhB模板来源于KO11菌株基因组。双基因表达质粒载体pACYCDuet-1购于Voergen公司。 1.2 引物设计 利用Primer premier 5.0软件对PDC和AdhB基因的开放阅读框序列设计引物。以pACYCDuet-1的多克隆位点1中的Sal作为PDC基因的插入点，而多克隆位点2中的Xho作为AdhB基因的插入位点。PDC和AdhB基因引物加上酶切位点和爱护碱基，并设计1对针对MCS1和MCS2多克隆位点载体构建的检测引物，引物序列如表1所示。 1.3 PDC和Adh

2、B基因克隆 以KO11菌液为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：模板菌液1 L，Buffer 2.0 L，dNTPs 0.4 L，引物A 0.5 L，引物B 0.5 L，DNA polymerase 0.2 L，ddH2O 15.4 L。PCR反应程序为：94 预变性4 min；35个循环；73 延长10 min。S-PDC-F和S-PDC-R引物退火温度54 ，X-AdhB-F和X-AdhB-R引物退火温度55 。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒纯化。PDC和AdhB两个基因的纯化产物分别用Sal和Xho进行单酶切，回收产物-73 保存备用。 1.4 PDC和AdhB双基

3、因表达载体构建 将含有pACYCDuet-1质粒的DH5菌株经37 、173 r/min过夜培育后提取质粒，并用Sal单酶切后通过凝胶回收。PDC基因片段的Sal酶切回收产物和pACYCDuet-1质粒的Sal酶切回收产物按31的比例，用T4 DNA 连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5感受态细胞9。然后将AdhB基因片段和pACYCDuet-1-PDC质粒的Xho酶切回收产物按浓度31的比例混合连接过夜。菌液PCR鉴定阳性菌，并将阳性菌种送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。 1.5 Ym68阳性菌株鉴定 依据噬夏孢欧文氏菌感受态的方法10制备Ym68菌株感受态细胞。从含有pACYCD

4、uet-1-PDC-AdhB质粒的大肠杆菌DH5菌株中提取质粒，参考Sambrook等11的转化方法。用含101 g/mL氯霉素的0.5%葡萄糖肉汤固体培育基进行筛选。随机挑取20个阳性菌落在0.5%葡萄糖肉汤液体培育基中扩繁。以MCS1-F和MCS2-R引物进行PCR鉴定阳性菌株。 1.6 木糖发酵及检测 将Ym68和PAP16菌株分别接种于肉汤培育基中，35 、180 r/min培育到OD600 nm为0.8左右时作为菌种。Ym68和PAP16菌株分别按5%的接种量接种到250 mL发酵培育基中，以不接种的发酵培育基作为比照，6个重复，35 、180 r/min进行发酵，73 h时进行还原

5、糖浓度和乙醇浓度检测。每个处理的6个重复样品中两两混合，形成3份混合样品，随后取每份样品进行总糖浓度检测；以未发酵过的发酵培育基为比照。按DNS显色法检测还原糖浓度12；以浓度为0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的木糖作标准曲线，随后对样品进行原糖浓度测定；混合样品经蒸馏后用酒精计法测定13。 1.7 苎麻脱胶 分别将初始菌株Ym68和工程菌株PAP16分别接种于肉汤培育基中，35 、180 r/min培育菌株过夜作为菌种。以加肉汤培育基为比照，分别用Ym68和PAP16菌种进行脱胶试验，称取每份15 g的苎麻放于500 mL三角瓶中用于脱胶试验，35 、150 r/min培

6、育8 h，每个处理3个重复。脱胶效果依据11分级14，经清水洗去可溶性物质并烘干后计算脱胶前后的干物质损失率。 1.8 菌液涂片显微视察 Ym68转化pACYCDuet-1空质粒的菌株命名为Ym68-K。将Ym68、Ym68-K和PAP16菌株分别接种于肉汤培育基中，35 、180 r/min转速恒温摇床培育过夜。培育好的菌液马上用于涂片，用结晶紫染色后用显微镜视察、拍照。 2 结果与分析 2.1 pACYCDuet-1-PDC-AdhB载体的构建 利用Xho单酶切位点在多克隆位点MCS2上插入的PDC基因长度为1 737 bp，而在多克隆位点MCS1上插入的AdhB基因为1 152 bp，如

7、图1所示。将两个基因插入pACYCDuet-1载体质粒后，提取质粒用Xho和Sal双酶切。结果表明，1 5002 000 bp间存在一条目的条带，而约1 000 bp处也存在一条目的条带，分别与PDC和AdhB基因大小相符，如图2所示。而在3 0005 000 bp间有一条较亮的条带，在约500 bp处还有一条弱带，这两条带与原始质粒双酶切位置大小相符。结果表明，pACYCDuet-1-PDC-AdhB表达载体构建胜利。 2.2 PAP16具有木糖发酵实力 对Ym68转化pACYCDuet-1-PDC-AdhB质粒后，随机对5号、6号、16号和20号阳性单菌落进行PCR鉴定。单菌落与带有pAC

8、YCDuet-1-PDC-AdhB质粒的大肠杆菌DH5扩增的条带大小一样，与预期载体构建后MCS1-F 和MCS2-R引物间的产物长度相符；而原始菌株Ym68则未扩增出该条带，如图3所示。结果表明，带有pACYCDuet-1-PDC-AdhB质粒的Ym68工程菌株构建胜利，16号菌株命名为PAP16。 用Ym68和PAP16菌株对含有5%木糖的发酵培育基进行发酵试验。从发酵后的还原糖浓度看，PAP16和Ym68对木糖的利用率基本相像。73 h发酵的Ym68菌株发酵液中还原糖浓度约为0.56%，而PAP16菌株发酵液的还原糖浓度约为0.23%；未经发酵的发酵培育基还原糖浓度为5.22%。从乙醇产

9、量方面看，PAP16菌株发酵液乙醇浓度约为1.6%，而Ym68菌株的在0.2%以下；未发酵的培育基则未量出读数，如图4所示。结果表明， Ym68原始菌被改造成PAP16后虽然对木糖利用率的影响不明显，但发酵生成乙醇的实力提高。 2.3 PAP16苎麻脱胶性能 为检验PAP16的脱胶实力，通过苎麻脱胶试验对比Ym68和PAP16脱胶性能，结果如图5所示。只加培育基处理的比照无脱胶效果，干物质损失率在1%以下；Ym68菌株的脱胶级数达到10级，干物质损失率为12%左右；而PAP16脱胶级数为7级，干物质损失率为8%左右。从试验重复结果看，PAP16菌株的脱胶实力稍有减弱。在菌株的培育过程中发觉，静

10、置后的PAP16菌液相比Ym68更简单出现菌体沉淀。因此，对悬浮后的菌液涂片视察，PAP16菌液中菌体呈凝合状态，而Ym68和转化有pACYCDuet-1空质粒的Ym68-K菌液其菌体则比较分散，PAP16的菌体凝合特性可能影响了其脱胶性能。 3 小结与探讨 脱胶菌株Ym68具有优良的苎麻脱胶性能，PDC和AdhB基因构建进去后其获得了发酵木糖产乙醇的实力。Ym68菌株属于欧文氏菌属，而欧文氏菌一般均可利用戊糖和己糖15，16，试验结果也证明Ym68菌株可以利用木糖。其发酵液乙醇浓度小于0.2%可能是误差形成的结果，而并非真正产生乙醇。PAP16发酵液中乙醇浓度达到1.6%、糖醇转化率达到24

11、%，说明将丙酮酸脱羧酶基因PDC和乙醇脱氢酶基因AdhB引入Ym68菌中使其获得了将木糖转化乙醇的实力。已早有类似探讨报道，整合PDC和AdhB基因的大肠杆菌，其产生乙醇的实力也是从无到有17。这些说明Ym68菌株本身具有汲取木糖的实力，但引入PDC和AdhB基因后使得木糖代谢往乙醇产物方向转化。引入PDC和AdhB基因可能变更了Ym68菌体表面特征使得该基因工程菌简单形成凝合，从而降低了其脱胶性能。通过改造代谢途径使得麻类预处理菌株获得利用木糖转化成乙醇产物的实力，这对探讨提高麻类原料利用率和推动麻类燃料乙醇技术供应了可借鉴的依据。 参考文献： 1 阮奇城，祁建民，胡开辉，等.红麻秸秆发酵转

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