2022年新型“磁包金”金磁纳米粒子免疫层析试纸条定量检测血清中的人绒毛膜促性腺激素.docx

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1、2022年新型“磁包金”金磁纳米粒子免疫层析试纸条定量检测血清中的人绒毛膜促性腺激素 张燚郝良文沈轩昂江湖黄小林熊勇华 摘 要 将油酸修饰的氧化铁纳米粒子（Oleic acid coated iron oxide nanoparticles， OC-IONPs）与油胺修饰的金纳米粒子（Oleylamine-coated gold nanoparticles， OA-AuNPs）通过乳液自组装法共封装在聚合物基质中， 合成了具有“磁包金”核壳异质结构的新型金磁纳米粒子（Magnetic coated gold nanoparticles， MGNPs）。由于OA-AuNPs聚集在内核， OC-I

2、ONPs分布于外壳， 有效避开了OA-AuNPs的磁屏蔽效应， 相较于传统“金包磁”型纳米结构， 此MGNPs具有高的磁饱和强度（为初始氧化铁纳米粒子的80%）和强的吸光度（为传统30 nm胶体金纳米粒子的12.5倍）。进一步以此MGNPs为免疫层析（Immunochromatographic assay， ICA）的新型双功能标记探针， 以人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin， HCG）为模型检测物， 建立了高灵敏检测人血清中HCG的免疫层析方法（MGNPs-ICA）。本探讨所构建的试纸条定量检测人血清中HCG的线性范围为0.97250 mIU/mL（

3、y=0.2561lnx-0.0429， R2=0.9816）， 检出限为0.97 mIU/mL; 试纸条的批内及批间回收率为93.7%109.1%， 相对标准偏差小于14.3%; 特异性试验结果表明， 本方法仅对目标物HCG有显著的信号响应。本方法检测结果与化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay， CLIA）结果具有较好的一样性（y=1.11x + 14.71， R2=0.958）， 但在检测时间、成本和便携性方面具有明显优势。本探讨合成的MGNPs具有优异的磁学性能和良好的光学传感性能， 能够显著改善免疫层析平台的检测性能。 关键词 磁包金纳米粒子; 免

4、疫层析试纸条; 人绒毛膜促性腺激素; 定量检测 1 引 言 生物标记物是客观评估生物过程、致病过程或治疗干预的重要指标1，2。定性和定量检测血液和尿液等体液中的生物标记物对疾病临床诊断具有重要的意义3，4。胶体金免疫层析技术（Gold nanoparticle based immunochromatographic assay， AuNP-ICA）结合了免疫标记与层析技术的优势， 具有检测速度快、操作简洁及价格低廉等优点， 是目前临床上应用最为广泛的即时检测技术之一57。但是， 该方法对于检测成分困难的样本， 常会因样品的基质干扰问题， 导致检测的灵敏度及精确性下降， 甚至出现假阴性或假阳性的

5、结果。免疫磁分别技术（Immuno-magnetic separation， IMS）通过磁介导的方式可以从困难基质中分别和浓缩目标分析物， 显著提高ICA方法的检测灵敏度和精确性8，9。但是， 传统的磁性纳米粒子（Magnetic nanoparticles， MNPs）的摩尔消光系数远低于AuNPs的摩尔消光系数， 难以提高ICA的检测灵敏度。 金磁双功能纳米材料由于兼具MNPs以及AuNPs磁、光双重优势， 近年来被广泛应用于生物标记、生物成像、生物分别以及检测等领域1012。其中基于金磁纳米材料的ICA已广泛应用于多种分析物检测， 如沙门氏菌13、黄曲霉毒素B214、寡核苷酸多态性15

6、、磺胺二甲嘧啶16等。然而， 上述金磁纳米材料多呈“金包磁”的纳米结构。该类材料因AuNPs的强磁屏蔽效应， 导致其磁响应实力极大下降17，18。本探讨组的前期工作显示， 以磁性材料为金纳米材料的外壳， 形成一种“磁包金”核壳异质结构的纳米材料（Magnetic coated gold nanoparticles， MGNPs）， 可有效避开金纳米材料对磁性材料的屏蔽效应; 此外， 通过增加金纳米材料在“磁包金”复合纳米材料中的质量百分比， 可以极大地提高MGNPs的光学活性， 进而提高ICA的检测灵敏度19。据此， 本探讨通过乳液自组装法将油酸化的氧化铁纳米粒子（Oleic acid coa

7、ted iron oxide nanoparticles， OC-IONPs）与油胺化的金纳米粒子（Oleylamine-coated gold nanoparticles， OA-AuNPs）共封装在聚（马来酸酐-alt-1-十八碳烯）（PMAO）中， 利用OC-IONPs及OA-AuNPs与PMAO的溶解性差异， 基于相分别原理合成了一种“磁包金”核壳异质结构的新型金磁纳米粒子（MGNPs）双功能材料。人绒膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin， HCG）是一种由胎盘滋养细胞产生的糖蛋白激素， 是妊娠诊断的常见生物标记物20，21。此外， 某些其它的疾病也会

8、产生HCG， 例如异位妊娠22和非滋养细胞肿瘤23（如生殖细胞肿瘤）等。本探讨以新型MGNPs为ICA的标记探针， 以HCG为检测物模型， 构建了检测血清中HCG的ICA方法。 2 试验部分 2.1 仪器与试剂 XYZ3000型点膜仪、自动切条仪（金标生物科技公司）; 电热恒温鼓风干燥箱、紫外-可见分光光度计（上海福玛试验设备有限公司）; JEOL JEM 2100型高辨别率透射电镜（日本电子株式会社）; ZEN3700纳米粒度及电位分析仪（英国马尔文公司）; GIC-S2022-S2型金标免疫层析读数仪（苏州和迈精密仪器有限公司）。 硝酸纖维素（NC）膜、样品垫、吸水纸及PVC底板（美国Mi

9、llipore公司）; HCG标准品、HCG-单克隆抗体、HCG-单克隆抗体、羊抗鼠二抗（重庆欣源佳和生物科技有限公司）; 人血清（索莱宝公司）; 牛血清白蛋白、PMAO、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfonate， SDS）、氯金酸（Sigma公司）; 其它试剂均为分析纯。 2.2 试验方法 2.2.1 MGNPs的合成 OA-AuNPs24及OC-IONPs25参照文献方法合成。MGNPs的合成按本探讨组已报道的方法19并略作改进。首先， 将5 mg PMAO、7 mg OA-AuNPs和3 mg OC-IONPs混合溶于100 L氯仿， 然后将氯仿溶液加入250 L

10、 SDS溶液（2 mg/mL）中充分混匀， 超声乳化2 min （功率76.8 W， 工作5 s， 暂停10 s）， 所得的细乳液于60下蒸发4 h， 随后以13500 r/min离心15 min以分别MGNPs， 将MGNPs用超纯水洗涤3次， 重悬于pH=10的超纯水中， 水解MGNPs表面PMAO的酸酐24 h， 离心收集羧基化MGNPs， 重悬于1 mL超纯水中。 2.2.2 检测探针（MGNPHCG-mAbs）的制备 采纳1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）介导的共价偶联法制备MGNPHCG-。详细过程为：将10 L MGNPs（12 mg/mL）和2 L HCG-m

11、Abs （3 mg/mL）加入到200 L 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PB， pH=7.4）中， 静电吸附30 min后， 加入10 g EDC进行偶联， 反应30 min后， 加入100 L （10 mg/mL）BSA封闭MGNPs表面多余位点， 13500 r/min离心15 min， 弃上清液， 沉淀重悬于50 L含25%蔗糖、1% BSA和0.1% NaN3的溶液中， 即得到检测探针MGNPsHCG-mAbs。 2.2.3 免疫层析试纸条的制备 将1 mg/mL HCG-mAbs和1 mg/mL羊抗鼠二抗以0.74 L/cm的速度分别喷涂于NC膜上作为试纸条的检测线（T线）和质

12、控线（C线）， 37干燥12 h。将NC膜、样本垫及吸水纸依次贴在PVC底板上， 切割成宽3.9 mm的小条， 置于卡壳中， 干燥环境中保存， 备用。 2.2.4 免疫层析试纸条定量检测HCG 检测流程如图1所示。将2 L MGNPsHCG-mAbs加入350 L人血清样品中， 室温孵育5 min， 磁性分别， 弃上清液， 随后加入70 L PB缓冲液重悬MGNPsHCG-mAbs， 将混合液滴加至试纸条加样孔中， 孵育10 min， 用胶体金读取仪读取试纸条ODT/ODC值（T线与C线的吸光度比值）， 依据标准曲线计算血清中HCG含量。C线为质控线， 若C线无显色读值， 则判定检测结果无效。

13、 2.2.5 免疫反应动力学分析 依据免疫反应动力学确定试纸条定量检测HCG的最佳判读时间。将2 L MGNPsHCG-mAbs与350 L血清样品（浓度分别为7.8、15.6和31.25 mIU/mL， 1 mIU/mL可换算为0.375 ng/mL）室温孵育反应5 min， 磁性分别， 将MGNPsHCG-mAbs复溶于70 L PB缓冲液中， 用胶体金读取仪每隔30 s记录试纸条ODT/ODC值， 连续监测 30 min。以反应时间为横坐标， ODT/ODC值为纵坐标， 绘制免疫反应动力学曲线， 以ODT/ODC值进入稳定期为试纸条定量检测HCG的最佳读取时间。 2.2.6 定量检测血清

14、中HCG的标准曲线 将HCG标准品加入到HCG阴性血清中， 配制HCG终浓度为0.242000 mIU/mL的血清标准溶液， 按2.2.4节进行磁性富集和试纸条检测， 10 min后读取试纸条ODT/ODC值， 各浓度样本重复检测3次。以HCG浓度对数值为横坐标， ODT/ODC值为纵坐标， 绘制标准曲线。 2.2.7 免疫层析试纸条性能评价 试纸条检测血清HCG的特异性通过分析试纸条对血清中常见8种生物标记物的交叉反应进行评价。8种常见生物标记物包括：甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、C反應蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、卵泡刺激素（FSH）、丙型肝炎抗原（HCV）、乙肝表面抗原（

15、HBsAg）， 葡萄糖（Glu）和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）。其中， FSH的亚基与HCG序列相像， 为HCG结构类似物， 其它为血清中常见疾病生物标记物。 试纸条的精密性和精确性通过批内及批间的加标回收试验进行评价。取HCG阴性血清样品， 分别添加HCG至终浓度为7.8、15.6和31.25 mIU/mL。批内分析为同一天内重复测定4次， 批间分析为连续测定3天， 每个浓度重复测定4次， 计算试纸条检测HCG的批内和批间加标回收率及相对标准偏差（RSD）。 试纸条的好用性和牢靠性通过与商业化学发光免疫分析（CLIA）试剂盒检测结果进行相关性分析进行评价。取HCG阴性血清样品， 随机添加

16、HCG至终浓度为202500 mIU/mL， 制备24份HCG阳性样本， 同时采纳本试纸条和商业化CLIA试剂盒进行检测， 每个浓度重复测定3次。 3 结果与探讨 3.1 MGNPs的表征 采纳乳液自组装法合成MGNPs。高辨别电子显微镜（TEM）图（图2A）显示， MGNPs呈现近球形， 具有典型的核壳异质结构， 粒径约为265 nm。动态光散射测定结果（图2B）显示， MGNPs的平均水化粒径为285 nm。由于OA-AuNPs在TEM成像中较 OC-IONPs具有更高的对比度， 因此MGNPs核心部位的暗点为OA-AuNPs， 壳层部位为OC-IONPs， 表现为典型的“磁包金”核壳纳米

17、结构。此结构的形成主要是由于OA-AuNPs和OC-IONPs在聚合物PMAO中的溶解度差异以及疏水作用力， 从而驱动OA-AuNPs和OC-IONPs在微球中实现了定向分布。 运用磁性能测量系统测量MGNPs的饱和磁化强度表征。由图3A可知， MGNPs的饱和磁化强度为28.1 emu/g， 为OC-IONPs（41.5 emu/g）的80%。MGNPs优异的磁学性能可能是因为OA-AuNPs优先聚集成核， 占据了MGNPs的内部空间， 使OC-IONPs主要分布在MGNPs的外壳层。外壳层的OC-IONPs有效规避了OA-AuNPs的磁屏蔽效应， 从而极大地保留了OC-IONPs的磁学特性

18、。为了探究MGNPs材料的光学特性以及对试纸条显色的贡献率， 进一步将等摩尔浓度的MGPNs和AuNPs（30 nm）喷涂在试纸条的NC膜上， 用胶体金读取仪读取其吸光值， 结果如图3B所示。在相同浓度（30 pmol/L）下， MGNPs在试纸条上的吸光值达到343.7， 比30 nm AuNPs高约12.5倍。MGNPs优越的光学特性得益于微球中包埋了大量的OA-AuNPs。综上， 本探讨合成的“磁包金”核壳结构的MGNPs具有优异的磁学以及光学特性， 可以作为磁分别的载体以及试纸条的信号输出探针， 提高试纸条的检测灵敏度。 3.2 MGNPs表面抗体标记量的优化 MGNPs表面标记的HC

19、G-mAbs量过少， 会影响探针对HCG的捕获效率， 而标记的HCG-mAbs过量， 会在MGNPs表面产生位阻效应， 反而导致HCG的捕获量降低。为了获得具有最佳活性的MGNPsHCG-mAbs， 本探讨进一步优化了MGNPs表面的抗体标记量。如图4所示， 当MGNPs微球表面抗体标记量从12.5 g/mg增加至50 g/mg时， 试纸条T线显色强度从606增加至963; 但是， 随着抗体标记量的进一步增加， 试纸条T线显色强度反而呈下降趋势。因此， 选择每毫克MGNBs标记50 g HCG-mAbs为最佳标记量。 3.3 免疫层析试纸条参数的优化 进一步优化了试纸条T线HCG-mAbs喷涂

20、浓度和MGNPsHCG-mAbs检测探针用量。如图5A所示， 随着HCG-mAbs喷涂浓度增加， 试纸条T线显色强度渐渐增加， 当T线HCG-mAbs喷涂量为1.0 mg/mL时， T线信号值趋于饱和。为了能够获得更宽的HCG检测线性范围， 避开过早出现“Hook”效应， 选择T线喷涂HCG-mAbs浓度为 2.0 mg/mL。进一步优化了MGNPsHCG-mAbs探针用量， 结果如图5B所示。当每张试纸条MGNPsHCG-mAbs探针用量为2 L时， T线显色信号趋于饱和， 因此选择单张试纸条的探针用量为2 L。 为了提高试纸条定量的精确度和重现性， 以试纸条ODT/ODC随免疫反应时间改变

21、绘制免疫动力学曲线， 通过免疫动力学曲线确定了试纸条定量检测HCG的最佳判读时间， 结果如图5C所示。随着免疫反应时间延长， 试纸条ODT/ODC比值渐渐降低， 10 min后即趋于稳定， 因此确定加样后10 min为试纸条定量检测的判读时间。 3.4 试纸条定量检测HCG的标准曲线 在最佳条件下， 采纳制备的免疫层析试纸条检测含不同浓度HCG的血清样本。以HCG浓度的对数值为横坐标， ODT/ODC值为纵坐标， 绘制标准曲线。如图6B所示， 当血清中HCG浓度从0.97 mIU/mL增加至250 mIU/mL时， 试纸条ODT/ODC值与HCG浓度对数值呈良好的线性关系：y=0.256lnx

22、-0.0429（R2=0.9816）， 其中， x为HCG浓度， y为ODT/ODC值。当血清中HCG浓度低于0.97 mIU/mL时， 试纸条T线吸光值为零， 因此确定试纸条检测血清中HCG的检出限为0.97 mIU/mL。由图6A可知， 当血清中HCG浓度大于1000 mIU/mL时， ODT/ODC值呈下降趋势， 试纸条有可能出现“Hook”效应。因此， 当采纳试纸条检测超高浓度的HCG时， 需将样本进行恰当稀释后进行检测。 3.5 试纸条的选择性和精密度 试纸条的特异性通过其与血清中其它常见生物标记物的交叉反应性进行评价。如图7所示， 当血清中FSH及Neu5Ac的浓度为1000 mI

23、U/mL， AFP、CEA、PCT、CRP、HCV、Glue以及HBsAg的浓度为1 g/mL， 试纸条T线上几乎无信号响应， 试纸条ODT/ODC值为零; 而血清中HCG浓度仅为62.5 mIU/mL， 试纸条ODT/ODC值达到1.086值， 表明试纸条對HCG具有高度的选择性， 可用于血清中HCG的特异性检测。 在血清中分别添加7.8、15.6 和31.25 mIU/mL的HCG， 每个浓度重复检测3次， 结果如表1所示， 批内及批间回收率为93.7%109.1%， RSD均低于14.3%， 表明MGNPs-ICA试纸条检测血清HCG具有较好的精确性和精密度。 3.6 实际样品分析 进一

24、步评价了MGNPs-ICA试纸条检测临床实际样品的精确率及牢靠性。从江西省人民医院收集了24例HCG阳性血清样品， 试验经过医院伦理委员会批准， 患者均知情同意。运用本探讨制备的试纸条以及市售CLIA试剂盒检测， 两种方法检测结果进行相关性分析。如图8所示， 两种方法检测血清样品中HCG具有良好的一样性， 表明MGNPs-ICA试纸条检测实际样本中HCG具有较好的好用性和牢靠性， 可望用于临床血清样品中HCG的快速检测。相较于传统CLIA试剂盒， 本探讨制备的试纸条在检测时间、 成本和便携性方面具有明显优势。 4 结 论 采纳乳液自组装法胜利合成了具有“磁包金”核壳结构的新型双功能纳米粒子。相

25、比于传统的“金包磁”纳米粒子， “磁包金”双功能纳米粒子的磁性组分（OC-IONPs）分布在微球的壳层， 从而有效地避开了AuNPs对磁性材料的磁屏蔽效应。此新型材料展示出较好的磁学特性（磁饱和强度为OC-IONPs的80%）和较优异的光学强度（在试纸条上的光信号强度为30 nm胶体金的12.5倍）。进一步以MGNBs为新型双功能标记探针， 建立了高灵敏检测血清中HCG的免疫层析新方法。MGNBs结合了磁性材料的富集、纯化优势， 同时又有较好的光学灵敏度， 检测血清中HCG灵敏度达到0.97 mIU/mL， 且检测临床实际样本的结果与商业化CLIA方法具有较好的一样性， 表明此新型“磁包金”良

26、好的好用性。 References 1 Dragsted L O， Gao Q， Scalbert A， Vergeres G， Kolehmainen M， Manach C， Brennan L， Afman L A， Wishart D S， Lacueva C A， Garciaaloy M， Verhagen H， Feskens E J M， Pratico G. Genes Nutr.， 2022， 13（1）： 1-14 2 Andre F， Mcshane L M， Michiels S， Ransohoff D F， Altman D G， Reisfilho J S， H

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38、sity， Nanchang 330047， China） Abstract A facile emulsion self-assembly strategy by co-assembling oleylamine-coated gold nanoparticles （OA-AuNPs） with oleic acid-coated iron oxide nanoparticles （OC-IONPs） into polymer nanobeads to form magnetic coated gold nanoparticles （MGNPs） was reported. The synt

39、hesized MGNPs exhibited a typical magnetic-coated gold core-shell heterostructure. Due to that OA-AuNPs aggregated in core and OC-IONPs assembled in shell， the magnetic shielding effect of OA-AuNPs was effectively avoided. Therefore， compared with the traditional gold-coated magnetic nanostructures，

40、 the MGNPs synthesized here had higher magnetic saturation intensity （80% of OC-IONPs） and strong absorbance （12.5 times that of the traditional 30 nm colloidal gold nanoparticles）. By using MGNPs as the dual-function labeled probe and human chorionic gonadotropin （HCG） as a model biomarker， a highl

41、y sensitive immunochromatographic method （MGNPs-ICA） for detecting biomarkers in human serum was established. The results showed that the linear range of the MGNPs-ICA strip for quantitative detection of HCG in human serum was 0.97-250 mIU/mL， and the linear regression equation was y=0.2561lnx-0.042

42、9 （R2=0.9816）. The detection limit was 0.97 mIU/mL. The intra-and inter-assay recoveries for HCG spiked serum were 93.7%-109.1%， and the coefficient of variation was less than 14.3%. The specific experimental results showed that the method only showed a significant signal response to target HCG. In

43、addition， the results of this method were in good agreement with those of chemiluminescence immunoassay （CLIA）. Compared with CLIA method， MGNPs-ICA method had significant advantages in detection time， cost and portability. In a word， the as-prepared MGNPs had excellent magnetic properties and stron

44、g optical sensing ability， and could significantly improve the detection performance of ICA platform. Keywords Magnetic coated gold nanoparticles; Immunochromatographic strip; Human chorionic gonadotropin; Quantitative detection （Received 1 June 2022; Received 25 September 2022） This work was suppor

45、ted by the National Key Research and Development Program of China （No. 2022YFC1602505）. 2022-06-01收稿; 2022-09-25接收 本文系“十三五”科技部重點研发安排专项项目（No. 2022YFC1602505）资助 * E-mail： yhxiongchen 第20页 共20页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页第 20 页 共 20 页