基于散射信号的超分辨光学相减显微镜-周前.pdf

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1、May物理化学学手E(Wuli HuaxueXueba01Acta肋岱-ChimSin2016，32(5)，1 1231 128 1123Article doi：1 03866PKUWHXB20 1 603234 WWWwhxbpkueducn基于散射信号的超分辨光学相减显微镜周 前1。23 于建强4朱建华1,2赵立波3袁景和3一李德胜5 吴魁6方晓红3(I四川大学物理学系，成都610064；二高能量密度物理及技术教育部重点实验室，成都610064；1中国科学院化学研究所分子纳米结构与纳米技术实验室，北京100190；4北方工业大学理学院，北京100144；中国科学院化学研究所高分子物理与化学

2、实验室，北京100190；6中国科学院化学研究所活体分析化学实验室，北京1001901摘要：现有的光学超分辨显微成像技术主要依赖于特殊的荧光标记物，其对于大多数非荧光样品的超分辨成像就变得无能为力。因此我们提出将光学相减显微技术应用到非荧光样品的成像当中，利用普通共聚焦光斑和面包圈型光斑分别激发样品的散射光成像，从而得到样品同一区域的两幅图像，再通过图像相减的方法提高了图像空间分辨率。不同于一般的超分辨成像方法，这种光学相减显微镜不需要特殊的样品预处理过程，同时两次成像的激发光强度可以保持在一个较低水平，避免r样品损伤的影响。随后金纳米小球和有机聚合物微丝的散射成像实验证明了光学相减显微镜可以

3、将空间分辨率提高到215 nm(033A，1A=650 nm)，并且通过探测散射信号得到更多的样品细节信息。关键词：超分辨显微镜；图像相减；非荧光成像；光散射成像中图分类号：0644Super-Resolution Optical Subtraction Microscopy UsingOptical Scattering ImagingZHOU Qianl。2一 YU JianQian94 ZHAO LiB03 LI DeShen95 WU Kui6ZHU JianHual一 YUAN JingHe3。 FANG XiaoHon930Department oJPhysicsSichuan U

4、niversity,Chengdu 610064P RChina；：Key Laboratory ofHigh Energy Density Physics andTechnology ofMinistry ofEducation，Chengdu 61 0064，P R China； 3KO，Laboratory ofMolecular Nanostructure andNanotechnology,Institute ofChemistry,Chinese Academy o厂Sciences，Beoing 100190，P R China； 4College o，Science，North

5、 China University Of Technology,Beijing i 00144P RChina；：State Key Laboratory ofPolymer Physics andChemistry,Institute 011Chemisto；Chinese Academy D，Sciences，Beoing 100190，尸RChina； 6Key Laboratory ofAnalyticalChemistry for Living BiosystemsInstitute o厂Chemistry,Chinese Academy ofSciences，Beijing 100

6、190,尸RChina)Abstract：The existing form of superresolution microscopy based on specific fluorescent tagging iS unableto obtain superresolution images of nonfluorescent samplesHencewe have developed optical subtractionmicroscopy for obtaining superresolution imaging in such casesThis method iS based o

7、n image subtractionbetween the two optical scattering images frOm generaI confocaI excitation and doughnut-shaped excitationrespectivelyUnlike suDer-resOlutiOn fluorescence microscopy,subtraction microscopy requires no preprocessingOf the sampleand the excitation power can be kept low to avoid sampl

8、e damageThe non-fluorescent imagingof gold nanobeads and polymer nanofibers has been realized lO demonstrate the feasibility of super-resolutionsubtraction microscopyThe IateraI resolution decreases to 21 5 nm(033A，1 A=650 nm)in subtraction imaging，Received：February 252016：Revised：March 22，2016；Publ

9、ished on Web：March 23，2016+Corresponding author Email：ihyuaniccas accn；Tel：+861 06256 679The project was supposed by the National Key Basic Research Program ofChina(973)(2013CB933701)，National Natural Science Foundation ofChina f21127901914131 19)and Key Technology Talent Program ofChinese Academy o

10、fSciences国家重点基础研究发展规划项目(973)(2013CB933701)，国家自然科学基金(211 27901，91413119)和中国科学院“关键技术人才”项目资助Editorial office of Acta PhysicoChimica Sinica万方数据1124 Acta Phys一ChimSin2016 V0132and greater imaging detail of the sample is achieved via optical scatteringKey Words：Super-resolution microscopy；Subtraction imag

11、ing；Nonfluorescence imagingOptical scattering imaging1 引 言几个世纪以来，光学显微镜的发展极大地提高了人们对细胞结构和细胞功能的认识，但由于光学衍射极限的存在，光学显微镜空间分辨率通常在数百纳米左右，这使得其在细胞器和分子水平的细胞生物学探测中受到了极大的限制。近来，一些基于荧光探针的超分辨光学显微镜打破了光学衍射极限的限制，其中包括随机光学重构显微技术fSTORM)1、光活化定位显微技术fPALM)2、受激辐射耗尽显微技术(STED)34等，这些成像技术依赖特殊的荧光分子基团，无法实现非荧光样品的超分辨成像。于此同时也出现了一些非荧光超

12、分辨成像的方法，例如Wang等5利用样品分子的电子吸收过饱和效应，在空间上调制了激发光斑点扩展函数，从而提高了非荧光样品成像分辨率。Ye等6设计了一种平面超薄透镜组，入射电场在透镜组相平面处几乎只有纵向分量，从而减少了光斑横向面积，提高光学空间分辨率。但这些方法往往利用了特殊的分子能级结构或光学体系，在适用性和实现难度上都有很大限制。而另一方面光学相减显微技术(optical subtraction microscopy)通过不同条件下两次成像相减的方法提高成像的空间分辨率，自理论上提出以来7，其主要用于简单快捷地提高荧光成像的空问分辨率和信噪比”上。虽然无法达到之前几种荧光超分辨技术数十个纳

13、米的空间分辨水平，但光学相减显微镜对激发光和样品并无特殊要求，这使得将其应用到非荧光样品成像成为可能。我们提出利用光学相减显微技术，通过两次光散射成像相减的方法来获得非荧光样品的超分辨图像，通过普通共聚焦光斑激发的散射成像作为被减图像，再使用面包圈型光斑激发同一区域的散射成像作为减数图像，两者相减来获得超分辨成像。因为无需特殊的荧光分子基团，不必考虑荧光激发和发射光谱对波长的限制，所以两次散射成像可以使用同一激发波长。另外光学相减显微成像技术相比于其他超分辨技术拥有几个优势：首先，激发光功率可以减低到普通共聚焦显微镜的水平，不同于STED显微技术使用高功率激光激发的情况，减小样品损伤和潜在的光

14、漂白现象。其次，被减图像和减数图像都通过共聚焦扫描的方式获得，其成像速度远远快于STORM和PALM显微技术。另外，采用样品分子普遍存在的散射光作为信号源，具有广泛的适用性。最后，在整个成像过程中只使用同一波长的激发光，并且两幅图像的采集相互独立，不存在时间同步的问题，这简化了整个系统的结构。实际上这个工作证明了光学相减显微技术可以被看作一种新型的结构光照明成像方法，同时应用到荧光和非荧光的超分辨成像当中。2基本原理和实现方法21 光学相减显微镜的基本原理在共聚焦成像中，显微镜的点扩展函数PSF(the pointspread function)可以被描述为PSF(x，Y)2 PSF，(x，Y

15、)PSF，(x，Y)O p(x，Y)(1)其中p(x，Y)是共聚焦系统针孔的尺寸，o是卷积运算符。PSF，(x，Y)和PSFj(x，Y)分别代表了激发物镜和收集物镜的点扩展函数，对于倒置共聚焦显微镜，激发物镜同时用作收集物镜，因此PSF，(x，Y)=PSF，(x，Y)=PSF，(z，Y)，PSF，(x，y)是侄0置共聚焦显微镜所使用物镜的点扩展函数，于是整个系统的点扩展函数又可以被描述为：PSF(x，Y)2 PSF肛，剜o p(x，Y) (2)则像平面中光场强度分布l(x，们被描述为I(x，Y)oc scat，Y)PSF(x，Y) (3)t。(x，Y)代表了在焦平面的散射信号强度分布，满足以下

16、关系：t。(x，Y)=a(x，y)L(x，Y)，其中G(x，Y)为散射截面，Io(x，Y)为外界激发光强分布。至此共聚焦光斑激发(confocal excitation)的散射图像，c(即相减显微镜当中的被减图像1和面包圈型光斑激发(doughnut excitation)的散射图像厶(即相减显微镜当中的减数图像)可以通过公式(2)和(3)进行计算。它们各自的点扩展函数PSF(x，Y)分别写成PSF。(x，Y)和PSF。(x，少)，并可以通过矢量衍射理论计万方数据NO5 周 前等：基于散射信号的超分辨光学相减显微镜 1125算出来”。1 3。对于我们的光学相减显微镜，两幅图像的激发波长都设定为

17、A=650 nm，并且以圆偏振光进入物镜后口消除各向异性对成像的影响，物镜数值口径A)为14。对于一个独立点的散射成像，其，c和厶的计算结果分别为图l的(a)和(b)，图1(c)则表示了两者相减得到的相减图像(，s)的横截面。在像平面中相减图像的强度分布五可以由以下式获得：卜II crId，i c 2Id (4、5 1 0，J。Jd 一其中r为一个可调参数，如图l(c)所示，在被减图像厶中单点的半高宽(FWHM)约为314 nm，而随着r值的增加，即减数图像权重增大时，相减图像的空间分辨率也随之提高。当r=1时，五的横截面的半高宽为240 nlTl，当r=2时，其减小至207 am。理论上空间

18、分辨率可以随，值增大而无限提高，但实际实验中受到面包圈型光斑中心光强无法完全为零，加上成像噪声的影响，当r过大时，会导致一1 O0 90 80 70 60 5睦州Um图1单点的相减成像模拟结果Fig1 Simulated subtraction imaging of an isolatedscattering point(a)：confocal excitation image intensity；(b)厶：doughnut excitationimage intensity,l=650 nm in(a)and(b)；(C)normalized line intensityprofiles o

19、f L，d and subtraction image L，when r=1 and r2 2，is a controllable parameter based on the signal tonoise ratio of subtraction image被减图像信号完全被减数图像淹没的情况，从而损失大量原有的图像细节，为了保证相减图像具有较高的信噪比，实验中，值通常事先设定为r=mean(Ic)mean(Idl，并在此基础上适当改变，值，通过计算不同r值条件下的相减图像信噪比，来确定相减图像信噪比达到最佳状态时，值的大小。22实验装置我们所使用的光学相减显微镜的基本结构是基于之前被报道过

20、的自制STED显微镜14的基础上设计完成的(如图2所示1。整个系统使用了普通倒置光学显微镜(IX71，Olympus，Japan)作为基本平台，利用超连续皮秒脉冲激光器(Fianium，Southampton，UK)作为光源，其波长范围从可见光波段到近红外波段(4501750 nm)，脉冲宽度为350ps，重复频率为l MHz。在激光器出口处设置一块窄带滤波片(BPF,FF016501325，Semrock，NewYork，USA)用以选择出650 nm作为激发波长。之后经过偏振光分离晶体(CVI，Albuquerque，USA)将光路分为偏振状态相互垂直的两路线偏振光，分别作为被减成像和减数

21、成像的激发光源。两路光又分别经过两组扩束透镜组(BEl，BE2)之后耦合到单模保偏光纤(SMF,THORLABSNew Jersey,USAl中以保证光束质量并简化整个成像系统。其中减数成像的激发光路又经由螺旋位相板(VPP,RPCPhotonics，Rochester,NYUSA)以获得02n的螺旋位相调制，在物镜焦平面处形成面包圈型光斑，I 盈SMF 夕1sz哦耐日；i霉wBPFtTS2 BE2 VPP眶圃：l图2超分辨光学相减显微镜的示意图Fig2 Schematic diagram of the super resolutionsubtraction microscopeSC：supe

22、r continuum laser；SPF：shon pass filter；BPF：bandpass filter；PBS：polarizing beam splitter；S1，S2：shutters；BEI，BE2：beamexpanders；SMF：single mode fibers；VPP：vortex phase plate；BS 1，BS2：beam splitter；QW：quarter wave plate；万方数据1126 Acta Phys一ChimSin2016 V0132螺旋位相板厚度对应激发波长650 nm，以保证面包圈型光斑质量。单模光纤输出的两路光先通过一块平

23、面分束镜(BSl，THORLABS，New Jersey,USA)耦合共线，再利用一块半反半透分束镜(BS2，THORLABS，New Jersey,USA)引入油介质物镜(UPlan Sapo，NA=14，100x，Olympus，Japan)后口以及实现激发光和散射信号光的分离。另外，一块四分之一波片(THORLABS，New Jersey,USA)被放置在分束镜BSl和BS2之间，以保证两路激发光都为圆偏振光。样品的散射信号通过同一物镜收集之后，经过一个共聚焦针孔后由光电倍增管探测器(PMT,THORLABS，New Jersey,USA)探测。整个系统的图像扫描通过安装在显微镜平台上的

24、压电位移台(P5453C7，PI，Germany)单线扫描移动来实现。PMT探测器和位移台都连接在一块数据采集卡(PCIe一6353，NI，USA)当中，以实现信号采集以及探测器与位移台同步等控制，而被减成像和减数成像的切换则通过两个快门fSl和S2，LS3T2，Uniblitz，USA)的开关来控制。被减成像和减数成像的激发功率一般为10 laW左右(物镜后口测得1，重复频率为l MHz，并且由于两者成像过程相对独立，所以不存在时间同步和对准。最后得到的所有实验数据的分析和演示都通过我们自己编写的Matlab程序进行。23样品的制备金纳米小球样品：采用购买的金溶胶溶液(西80 nm gold

25、 beadAccurate Chemical&ScientificCorporation，New York，USA)；f1 10 3 molL 1的聚乙烯醇溶液(PVA，SigmaAldrich Corporation，USA)以1：10的体积比混合后，超声30 min得到的混合溶液，随后旋涂(4000 rrain，30 s)至洗净的玻璃片上并晾干。有机聚合物微丝：10fw)聚异丁烯酸异丁酯的二甲基甲酰胺(DMF)溶液作为聚合物，通过电纺丝的方法在玻璃片表面制备有机聚合物微丝。聚合物针尖与玻璃片之间的电压为15 kVcm。有机溶剂流速为100 uLh。3实验结果和讨论31 金纳米颗粒的相减成像

26、我们首先利用80 nm金纳米颗粒成像来验证相减显微成像方法提高空问分辨率的能力。图3表示了样品同一区域(10肛m9“m)的普通共聚焦激发散射成像厶(被减图像)和相减显微成像五结果。实验中单个扫描步长为50 nm，采集时间为1 ms，被减图像和减数图像的激发光在物镜后口所测得的功率都为12 uW，脉冲重复频率为1 MHz，可调参数r=12。如图3(a)中所示的两个相邻金纳米颗粒(白色箭头所指处)，其无法通过普通共聚焦成像清楚地区分开来，而在经过厶和厶相减处理之后得到上，两个金纳米颗粒分别在五和I的横截面图如图3(d)所示，可见两个颗粒被清楚的区分开来。图3(e)显示了单个金纳米颗粒分别在共聚焦图

27、像和相减图像当中的横截面(图3(a)和图3(c)蓝色箭头所指处)，可测得共聚焦成像(图3(a)中金纳米颗粒的半高宽在319 nm，但在相减成像(图3(c)结果中金纳米颗粒半高宽减小到了215 nm，约为0332，相比于共聚焦成像的结果，空间分辨率有了明显的提高。32有机聚合物微丝的相减成像我们使用有机聚合物微丝作为成像样品进一步验证相减显微镜的空间分辨能力(图4)。为了确定聚合物微丝的真实尺度，我们采用扫描电子显微镜(SEM)对聚合物微丝进行了成像，如图4(a)所示，聚合物体系由细小的微丝和尺寸较大的纺锤体组成，微丝的宽度通常在180500 nm之间，而纺锤体宽度通常在数个微米。针对聚合物微丝

28、进行光学相减成像，两幅图像的扫面范围为30 um30 LLm，单个步长为60 nm，采集时间为1 ms，激发光功率都为12 uw，重复频率为1 MHz，调节参数r=085。对比扫描电子显微镜的结果，我们发现对于纺锤体而言只有纺锤体边缘的散射信号能被光学显微镜探测到，这是由于在介质边界处具有更强烈的散射信号所致。通过对比共聚焦图像(图4(b)和相减图像(图4(c)的结果可知，空间分辨率有了较大的提高，一些共聚焦成像中无法显示的图像细节在相减成像得到了展现。例如两幅图中白色箭头所指的一个小纺锤体位置，纺锤体边缘在共聚焦成像中重合到了一起，而在相减成像中两者被清楚地区分了开来(图4(d)o在蓝色箭头

29、所示单个微丝的位置，在相减成像中微丝两个边缘也被探测成像出来，而共聚焦成像中只是单线的形状(图4(e)。因此可以证明在复杂样品的成像中，相减显微成像技术也能显著提高图像的空间分辨率。上述实验结果证明了光学相减显微技术能够利用散射光作为信号源实现非荧光样品的超分辨万方数据No5 周 前等：基于散射信号的超分辨光学相减显微镜 l 127(a)3至5793 5um1 00 908一蒌 o 7璺o 6罂o 5b 0 4C孓0 30 20 10 07b)3呈5797 O 7 5 8 0 8 5 9 0Um3 5 7Um1 00 90 85 0 7禹06葡0 5古0 4孓0 30 20 10 OU040

30、(c)0 350 300 25o 20 呈53 5 7Um3 25 3 50 3 75 4 00 4 25UmFig3 Super-resolution imaging of the gold nanobeads by the subtraction microscopy(a)confocal excitation image；(b)doughnut excitation image；(c)super-resolution subtraction image；(d)normalized intensity profiles along lines indicated by white arro

31、ws in(a)and(c)；(e)normalized intensity profiles along lines indicated by blue awows in(a)and(c)The bar scale is 1 lam in(a)，(b)，and(c)1 0O 90 8芒0 7磊0 06岩05巨040量03020 10 00612E118246 12 18 240 0 6 1 2 1 8 2 4Um芒Q苟堕而Eo亡孓U0 70O 6066 12 18 24Um图4有机聚合物微丝的相减显微成像Fig4 Super-resolution imaging of the polymer

32、 nanofibers with the subtraction microscopy(a)scanning electron microscope(SEM)image ofpolymer nanofibers，the bar scale is l am in inset；(b)confocal image；(c)super-resolution subtraction image，the bar scale is 3am in(b)and(c)：(d)normalized intensity profiles along lines indicated by white arrows in(

33、b)and(c)；(e)normalized intensity profiles along lines indicated by bule arrows in(b)and(c)佰O000加加L0000000000川U-284112E丁OOO0005432100000O0万方数据1128 Acta Phys一ChimSin2016 V0132成像。不同于之前的超分辨成像技术需要利用荧光分子基团，光学相减显微技术的两路激发光原则上可以使用任意波长，无需高激发功率和复杂 样品制备过程，减小了样品的光损伤。4结论提出了利用光学相减显微镜获得非荧光样品超分辨成像，通过共聚焦散射成像作为被减图像，面包

34、圈形光斑激发的散射成像为减数图像，两图像相减的方法提高图像的空间分辨率，两者的激发波长可以为任意的单一波长，并且激发功率可以在较低水平。使用相减显微成像技术对金纳米颗粒以及有机聚合物微丝进行成像实验，结果证明金纳米颗粒半高宽从316 lqm下降至215am，约为0332；而聚合物微丝样品图像的空间分辨率也有明显的提高。由于实验采用散射光作为信号源，证明了光学相减显微镜适用于任何光学信号来源，其在生物医学以及其他领域的应用前景也得到了扩展。(5)f61(7)(8)(9)f101(12)References(1)Rust，MJ；Bates，M；Zhuang，X W Nature Methods 2

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36、tedStates ofAmerica 2000，97，8206doi：l 01 073pnas97 15 8206Hell，SW Science 2007，316，1153doi：101126science1l 37395Wang，P；Slipchenko，MN；Mitchell，J；Yang，C；Potma，E0；Xu，XF；Cheng，JXNatPhotonics 2013，7，450doi：101038NPHOTON 201397Ye，H；Qiu，cw；Huang，K；Teng，J；LukYanchuk，B；Yeo，sPLaserPhvs Left2013，lo，64doi：10108

37、81612-2011l 06065004Haeberle，O；Simon，BOptCommun 2009，282，3657doi：101016joptcom200906 025Dehez，H；Piche，M；De Koninck，Y OptExpress 2013，21，15912doi：1013640E 2l 015912Segawa，S；Kozawa，Y；Sato，SOpt Len 2014，39，4529doi：l O1 364OL39004529Kuang，CF；Li，S；Liu，、M；Hao，X；Gu，ZT；Wang，Y F；Ge，JH；Li，H F；Liu，XSci RepUK20

38、13，3，6doi：101038step01441Wolf,EProceedings ofthe Royal Society ofLondon Seriesa-Mathematical and Physical Sciences 1959，253，349doi：101098rspa 1959 0199Richards，B；Wolf,EProceedings ofthe Royal Society ofLondon Series n-Mathematical and Physical Sciences 1959，253，358doi：10 1098rspa19590200Klar，TA；Engel，E；Hell，SWPhys RevE 2001，64，9doi：l 01l 03PhysRevE640666 l 3Yu，J Q；Yuan，JH；Zhang，XJ；Liu，J L；Fang，XHChineseScienceBulletin 2013，58，4045 doi：101007s11434一O】3601】Z万方数据