基于丝网印刷电极的阻抗型免疫传感器用于检测烯效唑-韦林洪.pdf

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1、第44卷2016年2月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第2期258264DOI：1011895jissn02530820150391基于丝网印刷电极的阻抗型免疫传感器用于检测烯效唑韦林洪12 刘琳1 吕红映1 滕镇远1 康慧敏1 王颊胤“ 胡效亚11(扬州大学化学化工学院，江苏省环境材料与环境工程重点实验室，扬州225002)2(扬州职业大学生物与化工工程学院，扬州225009)摘要采用循环伏安法在丝网印刷碳电极表面电聚合聚苯胺壳聚糖复合膜，利用静电吸附作用固定烯效唑抗体，制备了检测烯效唑的阻抗型免疫传

2、感器。采用循环伏安法和电化学阻抗谱对电极修饰过程进行了表征，并考察了缓冲溶液pH值、温育温度及时间对免疫反应的影响。在优化的条件下研究了免疫传感器的性能。此免疫传感器具有灵敏度高、特异性强、重现性和稳定性好的特点，对烯效唑的线性检测范围为001100 mgL，相关系数为0999，检出限为8肛gL(30-)。白菜样品中添加005，010和10 mgkg烯效唑，平均回收率为985一1046，相对标准偏差为33一43，检测结果与气相色谱法的检测结果相符。关键词免疫传感器；电化学阻抗谱；烯效唑；丝网印刷电极1 引 言烯效唑(Uniconazole)是20世纪80年代推出的一种高活性植物生长延缓剂和杀菌

3、剂，广泛用于果树、蔬菜和大田作物等，以提高其品质和质量，但由此导致的药物残留问题引起了人们的关注。日本肯定列表中规定烯效唑的最大残留限量(MRL)为001 mgkg心o，我国食品安全国家标准食品中农药最大残留限量(GB 2763-2012)p1规定糙米和小麦、花生仁、油菜籽中烯效唑的MRL分别为01和005 mgkg。目前烯效唑残留检测研究较少，还没有国家标准方法。因此，建立烯唑残留检测方法对于保护环境和农产品质量安全具有重要意义。常用的烯效唑残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)H J、液相色谱一质谱法(HPLCMS)旧5 J、气相色谱法(GC)M1等。烯效唑及中间体相对分子质量较大、

4、极性较强，采用GC分析时气化温度高，保留时间长，准确度差，但灵敏度高J。HPLC准确度、稳定性好，但灵敏度比Gc稍低。HPLC-MS具有高特异性和高灵敏度，是目前广泛应用的方法J。但上述方法需要昂贵的仪器和专业的操作人员，对样品前处理要求高，分析时间长。张良等1建立了直接竞争酶联免疫分析法(dcELISA)测定苹果中的烯效唑，该法特异性强、灵敏度高、样品前处理简单，但需要对半抗原进行标记，且样品基质、操作等因素会影响测定结果，易产生假阳性。因此，有必要建立简便、快速、灵敏、特异性强的烯效唑检测方法。电化学免疫传感器具有响应速度快、灵敏度高、特异性强、测定时不受样品溶液颜色和浊度等因素的影响、携

5、带方便等特点，是目前残留分析技术的研究热点。但常见的金电极、铂电极和玻碳电极等价格较高，使用前需预处理，一旦损坏很难再生0|。近年来，基于丝网印刷电极构建的免疫传感器较好地解决了这些问题。丝网印刷电极(Screen-printed electrode，SPE)是集工作电极、参比电极、辅助电极为一体的可一次性使用的电极，具有制作简便、可批量生产、成本低、便于携带、操作方便、样品用量少等优点，避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题-11I，广泛用于环境监测2|、医疗诊断u列和食品安全检测141。本研究利用聚苯胺的导电性和壳聚糖的生物相容性，在丝网印刷碳电极(SPCE)表面修饰聚苯胺壳聚糖(

6、PANICS)复合膜，通过静电吸附作用固定抗体，制备了检测烯效唑的阻抗型免疫传感器，并成功用于白菜样品的检测。目前，尚未见电化学免疫传感器用于烯效唑检测的文献报道。2015_0512收稿，2015-11-18接受本文系国家自然科学基金(No21375116)江苏省高等职业院校国内高级访问学者计划资助项目(No2014FX092)江苏省环境材料与环境工程重点实验室2014年度开放基金项目(NoK14019)资助项目$Email：wangcyyzu。eduCD-万方数据第2期 韦林洪等：基于丝网印刷电极的阻抗型免疫传感器用于检测烯效唑2实验部分21仪器与试剂Autolab PGSTAT30电化学工

7、作站(荷兰Ecochemie公司)；CHl832B电化学工作站(上海辰华仪器公司)；丝网印刷碳电极(SPCE，工作电极直径4 mm，工作电极和辅助电极为碳电极，参比电极为AgAgCl电极，西班牙DropSens公司)；KQ一50DA超声波清洗机(昆山超声波清洗机有限公司)；AR2140电子天平(德国梅特勒一托利多公司)；GC2010气相色谱仪(日本岛津公司)，配ECD检测器；Mixplus涡旋混合器(合肥艾本森公司)；HGC12D氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。烯效唑单克隆抗体(Ab)由扬州大学环境科学工程学院提供；烯效唑(纯度92，江苏七洲绿色化工股份有限公司)；壳聚糖(CS，分子量为

8、20万，脱乙酰度95(国药集团化学试剂有限公司)；卵清蛋白(OVA，生物纯，西安生物有限公司)；其它试剂均为分析纯；002 moLL不同pH值的磷酸盐缓冲溶液(PBS)；实验用水均为超纯水(182 MQ cm，MilliQ超纯水系统，美国Millipore公司)。白菜购于当地市场。22免疫传感器的制备221聚苯胺壳聚糖膜的制备151 将10 mL 02 molL苯胺溶液(19 mL苯胺，加100 mL l molLHCl溶解)与10 mL，01壳聚糖溶液(01 g壳聚糖溶于2 mL 005 molL pH 5的醋酸缓冲液，用超纯水稀释至100 mL)混合，超声分散2 h，得到分散均匀的悬浊液。

9、取15止分散均匀的苯胺壳聚糖溶液滴在SPCE表面，以50 mVs的速率在-0209 V循环扫描15圈，用超纯水清洗电极，室温下晾干，得到PANLCSSPCE电极。222烯效唑免疫传感器的制备在PANICSSPCE表面滴加05 mgmL烯效唑抗体溶液10仙L，4。C放置12 h后用超纯水洗涤，得到AbPANCSSPCE电极，在其表面滴加5 mgmL OVA溶液10“L，375温育30 min，用超纯水清洗，制得免疫传感器(OVAAbPANLCssPCE)，4保存备用。23交流阻抗的测量在免疫传感器工作电极表面加入10仙L不同浓度烯效唑标准溶液或样品溶液，375下温育90 rain，取出依次用00

10、2 molL PBS(pH 70)和超纯水洗涤。在含有02 molL KCI的5 mmolL K，Fe(CN)。K。Fe(CN)。溶液中测定电化学阻抗谱，频率范围01105 Hz，使用开路电位，正弦波电位的振幅为10 mV。免疫反应前后阻抗的相对变化值(AR。)按下列公式计算：AR。()：鳖鲤竽二堕坐100 (1)“ct(Ab)其中，冠cl(培岫)是烯效唑与烯效唑单克隆抗体结合后的阻抗值；RcI(舳)是烯效唑抗体固定在电极表面后的阻抗值。24实际样品的制备准确称取10 g粉碎的白菜样品于50 mL离心管中，加入200 mL乙腈，于涡旋振荡器上高速(2500 rmin)振荡2 rain，过滤，收

11、集滤液至装有5 g NaCl的50 mL具塞量筒中，剧烈振荡1 rain，室温下静置15 min，使乙腈相和水相分层。移取10 mL乙腈相于20 mL刻度试管中，用氮气吹至近干，用丙酮定容至10 mL，备用。25气相色谱条件一J色谱柱：HP一5毛细管柱(30 in032 mm025 Ixm)。程序升温：初始温度120。C，保持2 rain；以6。Cmin升至300。C，保持5 min。进样口温度：260。C；检测器温度：320；流速：10 mLmin，尾吹：30 mLmin；进样量：1 IxL；进样方式：不分流进样。3结果与讨论31 免疫传感器制备与检测原理免疫传感器的制备及检测原理如图1所示

12、。首先在SPCE表面通过循环伏安法将苯胺电聚合生成万方数据分析化学 第44卷聚苯胺(PANI)薄膜，同时cs被包裹其中形成PANICS复合膜。该复合膜富含氨基、成膜性好，在电极表面具有良好的粘附性。利用抗体与复合膜之间的静电吸附作用将抗体固定到电极表面m1，然后用OVA封闭PANICS复合膜上未吸附抗体的活性位点。检测时，烯效唑与电极表面的抗体反应形成免疫复合物，阻碍了Fe(CN)：-4一探针分子和SPCE表面的电子转移，阻抗值变大，免疫反应前后阻抗的相对变化值(AR。)与样品含量呈正相关。【o塑Chitosan茹蟹一k一羔超芝霹，登乳越一麴丝网E删碳电极 。一蚧”1”ed carl“)”k“

13、k 。嫱黟oo 水咖 ；、麓黟=乙J i隶篓嚣黧溶液slmlm。聚P苯胺olyan院ilin聚槠echi始losan膜 谢烯嫂olla，璺揣。I，嬲)蛋白umln L，慧然A儿iliI忡，ll(mam m川 pn异m砌ranP 。“ f螺ann“0(Iy o” u ni”。嘲图1 基于丝网印刷碳电极的烯效唑免疫传感器的制备与检测不意图Fig1 Schematic illustration of fabrication process of screen-printed carbon electrode-based immunosensor andthe analysis of unieonaz

14、ole32免疫传感器的电化学特性321循环伏安法(CV)表征免疫传感器的电化学特性利用CV表征丝网印刷电极每一步修饰后的电化学特性，如图2A所示。裸电极(曲线a)显示了一对可逆性良好的氧化还原峰；当PANICS复合膜修饰到SPCE表面后，氧化还原峰电流有所降低(曲线b)，这是由于PANICS复合膜抑制了电子转移；当电极表面固定抗体、封闭OVA、烯效唑抗原与抗体的结合后，电极表面绝缘层逐渐增厚，如图2A中曲线C，d，e所示，电极的氧化还原峰电流逐渐下降。以上结果表明，固定在电极表面的抗体和形成的免疫反应复合物有效地封闭电极表面，抑制氧化还原探针和电极间的电子传递。322电化学阻抗谱(EIS)表征

15、EIS是研究电极修饰过程中电极表面变化的有力工具。电化学阻抗谱复平面图中处于高频部分的半圆部分对应于电子转移的过程，半圆的直径即电子转移阻抗(R。)，可用来描述电极表面的界面性质；处于低频部分的直线部分对应于电子扩散过程。图2B显示了SPCE每一步修饰过程的电化学阻抗图谱，可以看出，裸SPCE的阻抗谱(曲线a)近似呈一条直线，说明SPCE表面的电子传递主要受扩散控制。当PANICS复合膜修饰到SPCE表面后(曲线b)，R。增大，这是因为PANICS复合膜阻碍了Fe(CN)36-一探针分子和电极表面间的电子转移，导致阻抗值增大；当烯效唑单克隆抗体固定在PANICSSPCE上(曲线C)，R，明显增

16、加，这是由于烯效唑单克隆抗体的大分子结构阻碍了电子的传递，另一方面，此结果也证明了烯效唑单克隆抗体被成功地固定到PANICSSPCE；电极表面加入OVA后(曲线d)，R。值略有增加；但当加入烯效唑溶液后，尺。(曲线e)明显增大，这是由于烯效唑与烯效唑抗体反应生成的免疫复合物覆盖在电极表面，极大地阻碍了探针在电极表面的电子转移。33免疫传感器检测条件的优化取同一批次制备的免疫传感器，按照23节的方法，对1斗gmL烯效唑溶液(002 molL PBS)进行阻抗测定，考察溶液pH值、温育温度和时间对传感器阻抗的相对变化值(AR。)的影响。331溶液pH值的影响取同一批次制备的免疫传感器，分别检测不同

17、pH值的002 molL PBS配制、浓度为1 p,gmL的烯效唑溶液的阻抗值，结果如图3A所示。在pH 5570范围内，AR。随pH值增大而逐渐增大；在pH 7085范围内，阻抗值的相对变化值随pH值增大而减小。故选择免疫反应的最佳pH值为70。地逝万方数据第2期 韦林洪等：基于丝网印刷电极的阻抗型免疫传感器用于检测烯效唑 261图2不同修饰电极的循环伏安曲线(A)以及电化学交流阻抗谱(B)。扫描速度100 mVs，阻抗测定的振幅为10 mV，探针溶液为含有02 molL KCl的5 mmolfL K3Fe(CN)6K。Fe(CN)6溶液。(a)裸丝网印刷碳电极(SPCE)，(b)聚苯胺壳聚

18、糖丝网印刷碳电极(PANICSSPCE)，(c)烯效唑抗体PANICSSPCE(AbPANICSSPCE)，(d)卵清蛋白AbPANICSSPCE(OVAAbPANICSSPCE)，(e)烯效P,坐OVAAbPANICSSPC(UniconazoleOVAAbPANICSSPCE)Fig2 Cyclic vohammograms(A)and Nyquist plot(Z。VS Z。)for Faradaic impedance measurements(B)ofmodified SPCEs in 5 mmolL K“Fe(CN)6K4Fe(CN)6solution containing 02

19、molL KCl(a)，bareSPCE； (b)，PANICS!SPCE； (C)， AbPANIZCSSPCE； (d)， OVAAbPANICSSPCE；(e)，UniconazoleOVAAbPANICSSPCEScan rate was 100 mVsAmplitude of applied potential in EISwas 10 mV332温育温度对免疫反应的影响 传感器阻抗的相对变化值与温育温度的关系如图3B所示，在2045范围内，阻抗的相对变化值随温度升高先逐渐增大，在375时达到最大值，然后逐渐减小。因此，选择375。C作为免疫反应的最佳温育温度。333温育时间对免疫反

20、应的影响传感器阻抗的相对变化值与温育时间的关系如图3c所示。随着温育时间的延长，阻抗的相对值逐渐变大，当温育时间达到90 min时，阻抗的相对变化值达到最大，说明免疫反应已进行完全。因此，选择90 min作为免疫反应的最佳温育时间。图3缓冲溶液pH值(A)、温育温度(B)、温育时间(c)对免疫反应的影响。缓冲溶液为002 molL磷酸缓冲液，烯效唑浓度为1仙gmLFig3 Effect of buffer pH value(A)，incubation temperature(B)and incubation time(C)on immunoreaction between unieonazol

21、e and uniconazole antibodyThe sample is 1斗gmL unieonazole in 002 molL PBSbuffer34免疫传感器的性能341标准曲线用002 molL PBS(pH 70)配制不同浓度的烯效唑溶液，按23节方法测定阻抗值，其法拉第阻抗图谱见图4A。R。即半圆的直径，随烯效唑浓度的增加而逐渐增大。以阻抗的相对变化值(AR。)为纵坐标，烯效唑浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线(图4B)，烯效唑浓度在001万方数据分析化学 第“卷100 mgL范围内与R。()呈良好的线性关系，线性回归方程为尺。()=11278+35419c，相关系数R=09

22、99，检出限为8“gL(3盯)17 2。与文献报道的其它方法(表1)相比，本方法线性范围较宽，样品前处理简单，样品用量少，操作简便，样品基质不干扰测定，无需标记，即可满足烯效唑残留限量分析的要求。图4(A)不同浓度烯效唑与免疫传感器反应的法拉第阻抗图谱，ae：001，01，10，10，100 mgL；(B)烯效唑的标准曲线Fig4(A)Faradaic impedance spectra of immunosensor incubated with different concentrations of uniconazolemeasured in 5mmolL K3Fe(cN)6K4Fe(c

23、N)6containing 02 molL KCl，curves ae represent 001，01，10，10，100 mgL uniconazole，respectively，(B)Calibration curve for uniconazole表l 不同方法检测烯效唑的比较Table l Comparison of different methods for detection of uniconazole342免疫传感器的重现性和稳定性在白菜样品中添加10 mgkg烯效唑，取同一批次制备的6支免疫传感器检测，测定结果的相对标准偏差(RSD)为43(n=6)，说明传感器重现性好。将

24、同一批次制备的免疫传感器于4保存，每隔5天取出1支对浓度为10 mgL烯效唑溶液进行检测，结果表明，两个星期内免疫传感器的阻抗相对变化值没有明显改变；一个月后，阻抗的相对变化值变为原来的856。因此，此免疫传感器具有良好的稳定性。343免疫传感器的特异性在10 mgL烯效唑溶液(pH=70)中分别加入克百威、2，4-D丁酸、氰戊菊酯至终浓度为10，100和1000 mgL，测定其阻抗值。结果表明，加人干扰物质后阻抗值变化较小，相对误差小于6，表明传感器具有良好的特异性。35实际样品分析从本地不同超市、农贸市场随机抽取8份白菜样品，按24节方法制备样品溶液，部分样品溶液用002 molL PBS

25、(pH 70)稀释10倍后，采用EIS法测定，其余样品溶液直接用GC法测定，结果表明：仅有1个样品含有烯效唑，EIS和GC测得其残留量分别为00155和00148 mgkg，RSD分别为32和52(n=3)。选择未检出烯效唑的白菜样品进行添加回收率实验，EIS和GC的检测结果见表2。由表2可知：两种方法的检测结果基本吻合，EIS的平均回收率为9851046，GC的平均率为946一1053，表明本方法能够满足烯效唑残留检测的要求。加舳如万方数据第2期 韦林洪等：基于丝网印刷电极的阻抗型免疫传感器用于检测烯效唑 263表2 白菜中烯效唑的回收率实验结果Table 2 Average recover

26、y of uniconazole in cabbageReferences1 xu XinJuan，HUANG ZhongWen，SUN HalYanJournal of Henan Institute of Science and Technology，2007，35(4)：4749徐新娟，黄中文，孙海燕河南科技学院学报(自然科学版)，2007，35(4)：47492 YU Hong，LU Yi，WANG JingJing，YANG Tao，Zhang Huang-TaoXinjiang Agricultural Sciences，2011，48(1)：187193于红，鹿毅，王静静，杨涛，

27、张煌涛新疆农业科学，2011，48(1)：1871933 National Food Safety StandardMaximun Residue limitsfor Pesticides in FoodNational Standards of the PeopleS Republic ofChinaGB 27632012食品安全国家标准一食品中农药最大残留限量中华人民共和国国家标准GB 276320124 JIN QiYan，YUAN Xu，WANG PingModern Scientific Instruments，2014，5(10)：113-115晋齐艳，袁旭，王萍现代科学仪器，20

28、14，5(10)：1131155 ZHANG FengZu，FAN Su-Fang，GU KeJia，DENG KaiLin，PAN CanPingBullEnvironContamToxic01，2013，90(4)：4995036 XU GuoFeng，NIE JiYun，LI Jing，LI Hai-Fei，YAN ZhenPest&ide，2014，53(10)：736-738徐国锋，聂继云，李静，李海飞，闫震农药，2014，53(10)：7367387 WANG JingJing，SU Min，GONG ZhiGuo，SHANG De-JunChemical Analysis and

29、 Meterage，2014，23(5)：135138王静静，苏敏，巩志国，李世雨，尚德军化学分析计量，2014，23(5)：1351388 HUANG HeHe，ZHANG Jin，XU DunMing，ZHOU Hao，LUO Jia，L0 MeiLing，CHEN ShuBin，WANG LianZhuChinese Journal of Chromatography，2014，32(7)：707-716黄何何，张缙，徐敦明，周昱，罗佳，吕美玲，陈树宾，王连珠色谱，2014，32(7)：7077169 ZHANG Liang，WANG QunZhen，WANGNing，LIU ShuZh

30、aoChineseAnalChem，2012，40(1 1)：17301734张良，王泉振，王宁，刘曙照分析化学，2012，40(11)：1730173410 YANG XinElectrochemical Biosensors for Detection of Veterinary Drug and Pesticide Residues Based On Screen-printedCarbon ElectrodesNingbo：Ningbo University2010111213141516杨欣基于丝网印刷电极的电化学生物传感器及其在兽药和农药残留检测中的应用宁波：宁波大学，2010Za

31、hra T，Alireza K，Mohammad M AMicrochimActa，2014，181(910)：865891ZHANG JinGuo，KANG TianFang，XUE Rui，SUN XueChinese，AnalChem，2013，41(9)：13531358张金果，康天放，薛瑞，孙雪分析化学，2013，41(9)：13531358Truong L T N，Chikae M，Ukita Y，Takamura YTalanta，2011，85(5)：25762580Hervas M，Lopez M A，Escarpa ABiosensBioelectron，2010，25(7

32、)：1755-1760Raiu K，Marshal DBiosensBioelectron，2009，24(6)：17001705XUE HuaiGuo，SHEN ZhiQuan，ZHANG YiFeng，LI YongFangChemistry，2001，64(7)：402-406薛怀国，沈之荃，张一烽，李永舫化学通报，2001，64(7)：402406LIU XuePing，ZHANG YiFang，WU HuiWang，SHEN GuoLi，YU RuQinChinese上AnalChem，2012，40(8)1147一1152刘雪平，张一芳，吴会旺，沈国励，俞汝勤分析化学，2012，4

33、0(8)：11471152万方数据264 分析化学 第44卷tection of UniconazoleBased on Screen Printed ElectrodeWEI LinHon91，2，LIU Linl，LIJ Hongrin91，TENG ZhenYuanl，KANG HuiMinl，WANG ChengYin 4 1，HU XiaoYal1(College of Chemistry and Chemical Engineering，Jiangsu Key Laboratory of EnvironmentalEngineering and Materials，Yangzhou

34、 University，Yangzhou 225002，China)2(College ofBiological and Chemical Engineering，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，China)Abstract Polyanilinechitosan composite membrane was modified on the surface of a screen printed carbonelectrode by cyclic vohammetry(CV)，and then antiuniconazole ant

35、ibodies were immobilized on the electrodebased on electrostatic attractionThe impedance immunosensor for the determination of uniconazole Was thusconstructedCV and electrochemical impedance spectroscopy(EIS)were used to characterize theelectrochemical properties of immunosensorSeveral factors affect

36、ing the immunoreaction were investigated，including the pH of phosphate buffer saline(PBS)，incubation temperature and timeThe performance of theproposed immunosensor was investigated under the optimized conditionsThe immunosensor exhibitedadvantages of high accuracy，high sensitivity and specificity，g

37、ood reproducibility and stabilityTheimmunosensor could detect uniconazole in a linear range of 001-100 mgL(R=0998)，and the detectionlimit was 8斗gL(3盯)The average recoveries were 985一1046and the relative standard deviationswere 33-43at the spiked level of 005010 and 10 mgkg in cabbageand the detectio

38、n results wereconsistent with the results obtained by gas chromatographyKeywords Immunosensor；Electrochemical impedance spectroscopy；Uniconazole；Screen printed electrode(Received 12 May 2015；accepted 18 November 2015)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No21375

39、116)+_量卜至+-圣+-圣+量+量-圣+_量卜委-量+_圣+-圣+啼+_圣+_圣+_圣+_圣+龟+_圣+_量+龟+-圣+啼+-圣+-量+_量+啼+_圣+_量-嘻+_圣卜量+-圣+-圣+龟+量+圣+_圣+_圣卜圣+_量+-圣扣圣-量聚合物的裂解气相色谱一质谱图集日柘植新(Tsuge Shin)等著本书介绍了高分子裂解气相色谱分析方法，汇总了163种具有代表性的合成及天然高分子的标准裂解色谱图和热分析图，并针对每种物质的特征裂解产物给出相应的质谱图，读者可通过与这些质谱图的直接对照，方便地确认特征裂解产物的结构，由此推断复杂聚合物体系(如共聚物、多组分共混物)的组成和结构。书中给出了33种缩聚高分子在标准条件下的热分析图及主要特征反应产物的质谱图，亦具有很好的实用性。书 号：9787122252166 定价：1680元出版时间：2016年1月 开本：16 化学工业出版社出版万方数据