副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法的建立_刘双红.docx

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1、 副猪嗜血杆菌间接 ELISA 检测方法的建立 第 38 卷 第 7 期 2016 年 7 月 中 国 预 防 兽 医 学 报 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Vol. 38， No.7 Jul. 2016 doi: 10.3969/j.issn.1008-0425.2016.07.15 刘双红 1，李大鹏 2，徐胜奎 2，谢 芳 2，李 刚 2，李 婷 3，孙 斌 1*，王春来 2* (1. 黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319； 2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国 家重点实验室 /

2、 动物细菌病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001； 3. 东北林业大学 野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040) 摘 要 ：为建立一种快速检测副猪嗜血杆菌 (HPS)的血清学方法，本实验采用重组表达的 HPS 细胞致死膨胀 毒素 B 亚基蛋白 (rCdtB)作为包被抗原，幵对各反应条件进行优化，建立了检测 HPS 血清抗体的间接 ELISA 方 法 。 以该方法检测 HPS 阳性血清和其他猪病病原阳性血清，除了 HPS 阳性血清呈阳性外，其余均为阴性，表明 该方法特异性良好 。 批内重复和批间重复的最大变异系数分别小于 7 %和 8 %。 此外，将 CdtB-ELISA 方法与商 品化

3、试剂盒 BioChek HPS-OppA 间接 ELISA 抗体检测方法对背景明确的 116 份 HPS 阳性血清和 112 份 HPS 阴性 血清进 行 检测， 商品化试剂盒阳性 符 合率为 25 % ， 阴性血清符合 率 为 100 % ， 总 符 合 率 为 62 % ， 其 中 CdtB-ELISA 方法对阳性血清的检出率高于商品化试剂盒 。 应用 CdtB-ELISA 方法检测 330 份临床猪血清样品，结 果显示， HPS 抗体阳性检出率为 11.8 %。 该方法可以用于 HPS 的临床检测，为 HPS 流行病学调查和防控提供了 一种快速有效的检测方法 。 关键词 ：副猪嗜血杆菌；

4、 rCdtB； 间接 ELISA 中图分类号 ： S852.61 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1008-0589(2016)07-0576-04 Establishment and verification of indirect ELISA for detection of antibodies against Haemophilus parasuis LIU Shuang-hong1, LI Da-peng2, XU Sheng-kui2, XIE Fang2, LI Gang2, LI Ting3, SUN Bin1*, WANG Chun-lai2* (1. College of

5、 Animal Science and Technology, Heilongjiang August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China; 2. Division of Bacterial Diseases, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Resaerch Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China; 3. C

6、ollege of Wildlife Resources, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China) Abstract: In the present study, an indirect-ELISA (rCdtB-ELISA) for the detection of the antibody against Haemophilus parasuis in serum was established using the prokaryotic expressed subunit of cytolethal distending

7、toxin (rCdtB) as coating antigen. The rCdtB-ELISA was high specificity for detection of the antibody against H.parasuis, but no cross-reactions to the positive sera of TGEV, PRV, PCV2, CSFV, PEDV, PRRSV, E.coli, S.suis2, P.multocida and A.pleuropeumoniae. The coefficient of variation of intra- and i

8、nter batch repeatability test was lower than 7% and 8% , respectively. Moreover, comparison of the established rCdtB-ELISA with the commercial ELISA (BioChek HPS-OppA kit) for detection of 116 positive and 112 negative sera to H. parasuis, the results showed that the positive concordance rate was 25

9、% , the negative concordance rate was 100% , and the total concordance rate was 62% . While, a total of 330 clinical sera samples were detected using the rCdtB-ELISA, it showed that the positive rate of H.parasuis was 11.8%. Key words: Haemophilus parasuis; rCdtB; indirect ELISA *Corresponding autho

10、r 收稿日期 ： 2015-12-30 基金项目 ：副猪嗜血杆菌病和猪传染性胸膜肺炎防治技术研究与示范 (201303034)公益性行业 (农业 )科研专项 作者简介 ：刘双红 (1990-)，女，黑龙江拜泉人，硕士研究生，主要从事猪上呼吸道病研究 . * 通信作者： E-mail： ； 第 7 期 刘双红，等 . 副猪嗜血杆菌间接 ELISA 检测方法的建立 577 副 猪嗜血杆菌病由副猪嗜 血 杆 菌 (Haemophilus parasuis， HPS)引起，又称革拉瑟氏病 。 2 4 月龄的 猪易感，常见于 5 8 周龄的保育猪 。 収病率为 10 % 15 %，死亡率可达 50 %

11、1。 病猪体温升高 、 关节 肿胀进而収生运动障碍 、 呼吸困难 、 少数的猪表现 出神经症状 。 HPS 为猪上呼吸道的常在菌，因此当 猪患其他疾病时免疫力下降可继収该病 。 常与猪繁 殖与呼吸障碍综合症 、 圆环病毒病 、 伪狂犬病 、 猪流 感等病幵収，给养猪业造成严重的危害和经济损失 2-3。 目前， HPS 的致病因子尚不明确，但有文献报 道 细 胞 致 死 膨 胀 毒 素 (Cytolethal distending toxin， CDT)有利于 HPS 的黏附和侵入细胞 4。 CDT 为多种 革兰氏阴性菌产生的细菌蛋白毒素，该毒素属于热 不稳定家族成员，它能够引起细胞周期阻滞和靶

12、细 胞 凋 亡 5。 CDT 由 CdtA、 CdtB 和 CdtC3 个 亚 基 构 成 ，由 基 因 簇 cdtA、 cdtB 和 cdtC 编 码 。 其 中 CdtB 具 有 DNase 活 性 ， 而 CdtA 和 CdtC 主 要 负 责 递 送 CdtB 到 靶 细 胞 内 部 6。 牛惠等人研究収 现 ， 重 组 CdtA、 CdtB 和 CdtC 蛋白均能够引起 PK-15 细 胞 収 生强烈的反应，其中由重组 CdtA 和 CdtB 蛋白引収 PK-15 细胞释放的因子具有较强的催化功能 7。 本实验以重组的 HPS 细胞致死膨胀毒素的核心 亚 基 CdtB 蛋白为抗原建立

13、一种 简 便 、 敏 感 、 特 异 的间接 ELISA 方法 。 为 HPS 病的准确 、 快速诊断以 及流行病学调查和有效防制提供了一种快速有效的 检测方法 。 1 材料和方法 1.1 主要实验材料 大肠杆菌 (E.coli)、 猪链球菌 2 型(SS2)阳性血清和临床样品均由哈尔滨兽医研究所 动物 疫 病诊断与技术服务中心惠 赠 。 猪传染性胃 肠 炎病毒 (TGEV)、 猪伪狂犬病病毒 (PRV)、 圆环病毒 2 型 (PCV2)、 猪瘟病 毒 (CSFV)、 猪病毒性腹泻病毒 (PEDV)、 猪蓝耳病病毒 (PRRSV)、 多杀性 巴氏杆菌 (Pm)等阳性血清分别由哈尔滨兽医研究所相

14、关研究 室 惠 赠 。 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 阳 性 血 清 (APP)、 HPS 阳性和阴性血清及含有 pET-CdtB 重组质粒的 E.coli BL21(DE3)菌株均由本实验室保存 。 1.2 主 要 试 剂 BCA 蛋白定量试剂盒购自北京康 为世纪生物科技有限公司； HRP 标记的羊抗猪 IgG (IgG-HRP)购自 Abcam 公司 ； TMB 显色液购自天根 生化科技 (北京 )有限公司 。 1.3 抗原的制备 将含有 pET-CdtB 重组质粒 的 大 肠杆菌采用常规方法进行培养，将菌体悬起进行超 声破碎幵用 Ni 柱进行纯化 。 采用 BCA 蛋白定量试 剂盒测定

15、纯化后的蛋白浓度 。 1.4 CdtB-ELISA 方法的建立及条件优化 按照棋 盘法，将 rCdtB 蛋白分别稀释至 2 g/mL、 1 g/mL、 0 . 5 g/mL 和 0 . 25 g/mL 4 个 梯 度 ， 血 清 分 别 按 150、 1100、 1200 和 1300 倍稀释，每个梯度阴性 对照和阳性对照各重复 2 孔，按照间接 ELISA 操作 程序进行操作 。 检测其 OD450nm 值， P/N 平均值最大 的为最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数 。 幵对封闭 液和封闭条件 、 抗原抗体作用时间 、 酶标二抗的稀 释倍数和作用时间 、 底物显色时间等反应条件进行 优化 。

16、1.5 临界值的确定 采用本实验建立的间接 ELISA 方法检 测 114 份 HPS 阳性和 109 份 HPS 阴性血清， 每份 血 清 重 复 2 孔，同时设阴性对照和阳性对照 。 S/P=(待检样品的平均值 - 阴性对照平均值 )/(阳性对 照平均值 - 阴性对照平均值 )，将阳性血清和阴性血 清的 S/P 值输入 Medcalcsetup 软件中，测出临界值 。 1.6 特 异 性 试 验 应用本实验建立的 ELISA 方 法 分 别 检 测 TGEV、 PRV、 PCV2、 CSFV、 PEDV、 PRRSV、 E.coli、 SS2、 Pm、 APP 和 HPS 阳 性 血 清

17、， 每个样品各 2 孔取平均值，同时设阴性和阳性对照 。 1.7 重复性试验 批内重复试验采用同一批包被的 酶标板检测 3 份已知的 HPS 阳性血清和 3 份阴性血 清，不同时间重复检测 3 次 。 批间重复试验采用不 同批次的包被板 ， 同一时间重复检测以 上 6 份 血 清 。 每个样品重复 2 孔，检测其 OD450nm 值，根据平 均值和标准差计算变异系数 。 1.8 符合率试验 分别应 用 BioChek HPS-OppA 间 接 ELISA 抗体检测试剂盒 和 本实验 建 立 的 CdtB- ELISA 方法检测背景明确的 116 份 HPS 阳性血清和 112 份 HPS 阴性

18、血清，比较二者的符合率 。 1.9 临床样品检测 采用建立 的 CdtB-ELISA 方 法 对来自哈尔滨兽医研究所动物疫病诊断与技术服务 中心的 186 份临床猪血清 、 内蒙古检测中心 92 份临 床猪血清以及本实验室临床抽检的 52 份猪血清进行 检测，对该方法的临床应用情况做出初步评价 。 Serum sample 平均值 标准差 变异系数 平均值 标准差 变异系数 XSD CV% XSD CV% 阳性血清 1 1.1900.025 2.1 1.2380.035 2.9 Positive serum 2 0.8270.030 3.6 0.8210.036 4.4 3 0.6370.02

19、3 3.6 0.6350.048 7.6 阴性血清 1 0.2170.008 3.6 0.2210.003 1.4 Negative serum 2 0.2120.005 2.6 0.1950.016 8.0 HPS-OppA 29 112 141 图 1 CdtB-ELISA 临界值结果 CdtB-ELISA 116 112 228 578 中 国 预 防 兽 医 学 报 2016 年 2 结 果 2.1 CdtB-ELISA 最佳反应条件的确定 采用 BCA ELISA 抗体检测试剂盒的总符合率为 62 % (表 4)。 表 2 CdtB-ELISA 特异性试验结果 Table 2 The

20、 specificity test of CdtB-ELISA 蛋白定量试剂盒测定纯化后的 rCdtB 蛋白浓度结果 为 0.197 g/L。 通过棋盘法确定 rCdtB 的包被浓度 和待检血清的稀释比例，最佳显色时间为室温显色 30 min。 本实验确定的最佳反应条件见表 1。 表 1 CdtB-ELISA 反应条件的优化结果 Table 1 The optimized conditions of CdtB-ELISA 血清 (阳性 ) Serum (Positive) TGEV RV PCV2 CSFV PEDV PRRSV E.coli 数 量 Number 1 1 4 10 3 15

21、10 检测值 (S/P) Test value (S/P) S/P0.2417 + dilutions 反应条件 Reaction conditions 4 /12 h 4 /2 h 37 /0.5 h 37 /1.5 h 表 3 CdtB-ELISA 批内和批间重复性试验结果 Table 3 The intra batch and inter batch repeatability test of CdtB-ELISA 内重复性试验 批间重复性试验 2.2 临 界 值 的 确 定 根 据 检 测 的 114 份 HPS 阳 性 和 109 份 HPS 阴性血清的 OD450nm 值计算 S/

22、P 值，经 计算临界值为 0.2417。 即 S/P0.2417 为阳性， S/P 0.2417 为阴性 (图 1)。 血清样本 Intra batch repeatability Inter batch repeatability test 3 0 . 119 0 . 008 6 . 9 0 . 110 0 . 005 4 . 2 表 4 CdtB-ELISA 与 HPS-OppA 试剂盒符合率结果 Table 4 The coincidence rate of CdtB-ELISA and HPS-OppA Kit 已知背景血清 (HPS-OppA 符合率 ) 试剂盒名称 Backgrou

23、nd-clear serum Kit name 阳性血清 阴性血清 总数 Positive serum Negative serum Total Commercial kit Fig. 1 The cut-off value of CdtB-ELISA 2.3 特异性试验结果 应用 CdtB-ELISA 方法分别 符合率 Coincidence 25 % 100 % 62 % 检测 TGEV、 PRV、 PCV2、 CSFV、 PEDV、 PRRSV、 E.coli、 SS2、 Pm、 APP 和 HPS 阳性血清，结果 HPS 血 清 为 阳 性 ， 其 余 均 为 阴 性 ( 表 2)，

24、表 明 建 立 的 ELISA 方法特异性良 好 。 2.4 重复性试验结果 重复性试验结果显示，批内 变异系数小于 7 %，批间变异系数小于 8 % (表 3)， 表明该方法的重复性良好 。 2.5 符合率试验结果 CdtB-ELISA 方法与 BioChek HPS-OppA 间接 ELISA 抗体检测试剂 盒 比 较 分 析 背 景明确的 116 份 HPS 阳性血清和 112 份 HPS 阴性血 清 。 结果显示， CdtB-ELISA 方法与 HPS-OppA 间接 2.6 CdtB-ELISA 的临床检测 应用本实验建立的 CdtB-ELISA 方法对来自哈尔滨兽医研究所动物疫病

25、诊断与技术服务中心的 186 份临床猪血清 、 内蒙古 检测中心 92 份临床猪血清以及本实验室临床抽检的 52 份猪血清进行检测， 检测结果显示， 39 份 为 阳 性，其阳性检出率为 11.8 %。 3 讨 论 HPS 给我国大型猪场造成了严重的经济 损 失 。 所以，建立快速准确的检测方法乃是当务之急 。 由 第 7 期 刘双红，等 . 副猪嗜血杆菌间接 ELISA 检测方法的建立 579 于间接 ELISA 方法特异性好 、 敏感性高，所以常用 于 血 清 学 检 测 。 进 口 的 BioChek 公 司 的 HPS 间 接 参考文献 ： ELISA 抗体检测试剂盒价栺非常昂贵，而且

26、特异性 不够好，而国内市场又没有此类产品 。 因此，有必 要 建 立 一 种 快 速 、 敏 感 和 特 异 的 HPS 抗 体 检 测 方 法 。 间接 ELISA 检测方法需要选择合适的包被抗原 , 因超声裂解的菌液上清中含有大量菌体可溶性蛋白 和多糖抗原，常被选作血清学诊断方法的抗原 。 本 实验采用的包被抗原为单一的蛋白抗原，经滤膜过 滤和 Ni 柱亲和层析纯化后具有很高的纯度，去除了 其他菌体蛋白和多糖可能导致的交叉反应，从而提 高了诊断的特异性和准确度 。 本实验之所以选用 CdtB 作为包被抗原，是因为 到 目前为止还没有収 现 HPS 种特异性的蛋白 ； 而 CDT 毒素只在少

27、数感染猪的细菌中存在，如少数大 肠 杆菌和空肠弯曲杆菌等，保 证 了 CdtB 蛋 白 作 为 HPS 种特异性蛋白的相对可靠性 。 据文献报道， 15 个 HPS 参 考 菌 株 和 109 个临床分离株均能够表 达 CdtB 亚 基 6， 说 明 CdtB 蛋 白 在 HPS 中 比 较 保 守 。 从 与 BioChekHPS (HPS-OppA) 抗体检测试剂盒 符 合 率比较来看本研究建立的方法较好 。 在背景明确的 116 份 HPS 阳性血清 (本实验室人工免疫灭活苗制备 的猪血清 )的检测中， BioChek 试剂盒只检出了 29 份 (符合率 25 %)，说明 BioChek

28、 试剂盒的敏感性不如 本实验建立 的 CdtB-ELISA。 BioChek 试 剂 盒 采 用 的 包 被 抗 原 是 OppA 蛋 白 ，寡 肽 结 合 蛋 白 OppA 是 一 种依赖于 H 离子的转运子，属于 ABC transporters 家 族，参与蛋白 、 肽段 、 代谢物 、 离子或电子的跨膜 转 运 8 。 通常，作为具有重要功能的家族 蛋 白 ，在 许多细菌间均很保守 。 OppA 在氨基酸水平上，与 多 杀 巴氏杆 菌 、 耶尔森氏菌以及沙门 氏菌等均 具 有 较高的同源性 ，达 到 60 % 左 右 8-11。 因 此 ，如 果 猪 感染了上述细菌，尤其是与 HPS

29、亲缘关系较近的细 菌，如多杀巴氏杆菌，则很可能出现假阳性 。 本实验建立的 CdtB-ELISA 具有较好的特异性， 可 以 用 于 HPS 的 临 床 检 测 ， 为 HPS 流 行 病 学 调 查 和防控提供了一种快速有效的检测方法 。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Solano G I, Segales J, Collins J E, et al. Porcille reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) interaction with Haemophilus parasuis J. Vet Microb

30、iol, 1997, 55 (1-4): 247- 257. Narita M, Kawashima K, Matsuura S, et al. Pneumonia in pigs infected with pseudorabies virus and Haemophilus parasuis serovar 4 J. J Comp Pathol, 1994, 110: 329-339. Kim J, Chung H, Jung T, et al. Postweaning multisystemic was Haemophilus agning syndrome of pigs in Kor

31、ea： prevalence, microscopic lesions and coexisting microorganisms J. J Vet Med Sci, 2002, 64: 57-62. Zhang Bin, He Yan-bing, Xu Cheng-gang, et al. Cytolethal dis-tending toxin (CDT) of the Haemophilus parasuis SC096 strain contributes to serum resistance and adherence to and inva- sion of PK-15 and

32、PUVEC cells J. Vet Microbiol, 2012, 157: 237-242. Matangkasombut O, Wattanawaraporn R, Tsuruda K, et al. Cy- tolethal distending toxin from A ggregatibacter actinomycetem- comitans induces DNA damage, S/G 2 cell cycle arrest, and cas- pase-independent death in a Saccharomyces cerevisiae model J. Inf

33、ect Immun, 2010, 78(2): 783-792. Zhou Ming-guang, Zhang Qiang, Zhao Jian-ping, et al. Haemo- philus parasuis encodes two functional cytolethal distending tox- ins: CdtC contains an atypical cholesterol recognition/interaction region J. PLoS One, 2012, 7: e32580. 牛惠，李艳玲，周泷，等 . 副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒 素 各 亚 基 处

34、 理 PK-15 细 胞 的 基因表达谱分析 J. 中 国 预 防 兽医学报， 2015， 37(5)： 372-374. Detmers F J , Lanfermeijer F C, Poolman B. Peptides and ATP binding cassette peptide transporters J. Res Microbiol, 2001, 152(3-4): 245-258. Gominet M, Lamti L, Gilois N, et al. Oligopeptide permerse is required expression of the Bacillus

35、 thuringiensis plcR regulon and for virulence J. Mol Microbiol, 2001, 40(4): 963-975. Solomon J, Su L, Shyn S, et al. Isolation and characterization of Mutants of the Bacillus subtil is oligo peptide permease with al- tered specificity of oligopeptide transport J. J Bacteriol, 2003, 185(21): 6425-6433. Miller M B, Bassler B L. Quorum sensing in bacteria J. Annu Rev Microbiol, 2001, 55(1): 165-199. (本文编辑：李 爽 )