抗体药物制备工艺课件.ppt

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1、制药工艺学制药工艺学Pharmaceutical Technology抗体药物制备工艺抗体药物制备工艺第一节第一节 抗体概述抗体概述第二节第二节 鼠源单克隆抗体制备鼠源单克隆抗体制备第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体第一节 抗体概述一、抗原与抗体一、抗原与抗体二、抗体结构二、抗体结构三、抗体制备技术的发展三、抗体制备技术的发展概述概述抗体制备抗体制备一、抗原与抗体一、抗原与抗体概述概述抗体制备抗体制备1、抗体、抗体 的概念的概念 抗体是能与相应抗原特异性结合的具有特定功能抗体是能与相应抗原特异性结合的具有特定功能免疫的球蛋白。免疫的球蛋白。 它与免疫球蛋白的区别：抗体都是免疫球蛋白，它与免

2、疫球蛋白的区别：抗体都是免疫球蛋白，免疫球蛋白不一定都具有抗体活性功能。免疫球蛋白不一定都具有抗体活性功能。 抗体是一个生物学和功能性概念，而免疫球蛋白抗体是一个生物学和功能性概念，而免疫球蛋白是一个结构性概念。是一个结构性概念。概述概述抗体制备抗体制备2、抗原的概念、抗原的概念 抗原是能抗原是能刺激机体产生免疫应答并能与应答产物刺激机体产生免疫应答并能与应答产物( (抗体或免疫效应细胞抗体或免疫效应细胞) )特异结合的物质特异结合的物质 蛋白质性抗原：在缺乏蛋白质性抗原：在缺乏T T淋巴细胞时，不能引起抗淋巴细胞时，不能引起抗体产生反应，也称为体产生反应，也称为T T依赖性抗原。依赖性抗原。

3、 非蛋白抗原：包括多糖、脂类及核酸等，在无非蛋白抗原：包括多糖、脂类及核酸等，在无T T细细胞时，也能产生抗体，称为非胞时，也能产生抗体，称为非T T依赖性依赖性抗原。抗原。概述概述抗体制备抗体制备3、抗原的概念、抗原的概念 抗原中与抗体结合的部位为抗原决定簇或表位，抗原中与抗体结合的部位为抗原决定簇或表位， 蛋白性抗原：多个不相同决定簇，非多价抗原。蛋白性抗原：多个不相同决定簇，非多价抗原。 线性决定簇：相邻的氨基酸残基构成，一般包括线性决定簇：相邻的氨基酸残基构成，一般包括6 6个氨基酸残基个氨基酸残基 构象决定簇：空间相互靠近的氨基酸残基组成。构象决定簇：空间相互靠近的氨基酸残基组成。

4、多糖、核酸抗原：多个相同决定簇，多价抗原多糖、核酸抗原：多个相同决定簇，多价抗原概述概述抗体制备抗体制备二、抗体结构二、抗体结构概述概述抗体制备抗体制备1、抗体、抗体 的生成的生成 在在B B淋巴细胞分化为浆细胞的过程中，生成抗体淋巴细胞分化为浆细胞的过程中，生成抗体 非成熟非成熟B B淋巴细胞阶段：合成淋巴细胞阶段：合成和和轻链，与轻链，与链链组装形成组装形成IgMIgM，表达于细胞表面。，表达于细胞表面。 抗原与成熟抗原与成熟B B淋巴相遇，抗原与淋巴相遇，抗原与IgMIgM和和IgDIgD结合，结合，B B细细胞增殖活化为浆细胞，促使抗体胞增殖活化为浆细胞，促使抗体V V区发生突变，即区

5、发生突变，即亲和力成熟。抗体由膜型转变为分泌型时，亲和力成熟。抗体由膜型转变为分泌型时，C C区发区发生类别转换，便于抗体行使功能。生类别转换，便于抗体行使功能。概述概述抗体制备抗体制备1、抗体、抗体 生成生成 在一种抗原刺激下，生成的抗体具有多样性，这是在一种抗原刺激下，生成的抗体具有多样性，这是因为：因为： 每种抗原能具有不同的抗原决定簇，每一种抗原决每种抗原能具有不同的抗原决定簇，每一种抗原决定簇可由达定簇可由达1000-80001000-8000种不同的抗体所识别。种不同的抗体所识别。 不同种系动物产生抗体混合物也不同不同种系动物产生抗体混合物也不同 不同个体对于同一抗原决定簇的反应也

6、不同不同个体对于同一抗原决定簇的反应也不同 即使同一个个体在不同时间的反应也不尽相同即使同一个个体在不同时间的反应也不尽相同概述概述抗体制备抗体制备2、抗体、抗体 与抗原的相互作用与抗原的相互作用 抗体的抗体的V V区互补决定区形成的三维构象与抗原高级区互补决定区形成的三维构象与抗原高级结构表面的决定簇之间的反应，非共价键结合，包结构表面的决定簇之间的反应，非共价键结合，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用力等。括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用力等。 抗体的功能是结合抗原，通过三种方式中和、除去抗体的功能是结合抗原，通过三种方式中和、除去有害物质：有害物质： 直接使抗原失活；直接使抗原失

7、活； 使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏；使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏； 抗原表面弱化，易受补体破坏。抗原表面弱化，易受补体破坏。概述概述抗体制备抗体制备3 3、抗体的结构、抗体的结构 单体由单体由2 2条相同的重链和条相同的重链和2 2条相同的轻链组成的四聚体。条相同的轻链组成的四聚体。 轻重链间和重链间以二硫键连接，形成轻重链间和重链间以二硫键连接，形成“Y”Y”字型结构。字型结构。概述概述抗体制备抗体制备三、抗体制备技术发展三、抗体制备技术发展 1919世纪末世纪末: :用天然抗原通过免疫动物，从血清中获得用天然抗原通过免疫动物，从血清中获得多克隆抗体，为第一代抗体。缺点是非特异性，交

8、多克隆抗体，为第一代抗体。缺点是非特异性，交叉反应。叉反应。 2020世纪世纪7070年代年代:B:B细胞与骨髓瘤细胞融合细胞与骨髓瘤细胞融合, , 杂交瘤生杂交瘤生产，一种抗原决定簇的均一单克隆抗体，第二代抗产，一种抗原决定簇的均一单克隆抗体，第二代抗体。缺点是存在免疫原性体。缺点是存在免疫原性 2020世纪世纪8080年代后：人源化抗体、小分子抗体并用原年代后：人源化抗体、小分子抗体并用原核细胞表达抗体，第三代基因工程抗体。核细胞表达抗体，第三代基因工程抗体。概述概述抗体制备抗体制备第二节第二节 鼠源单克隆抗体的制备鼠源单克隆抗体的制备一、杂交瘤细胞系的建立一、杂交瘤细胞系的建立二、杂交瘤

9、细胞的培养二、杂交瘤细胞的培养三、抗体的分离纯化三、抗体的分离纯化鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备一、杂交瘤细胞系的建立一、杂交瘤细胞系的建立淋巴细胞的制备淋巴细胞的制备: :按免疫程序，用特异性抗原免按免疫程序，用特异性抗原免疫纯系健康疫纯系健康8 8周龄的周龄的BALB/cBALB/c小白鼠，分离小白鼠，分离B B淋巴淋巴细胞。细胞。骨髓瘤细胞：核酸代谢旁路酶缺陷型（次黄嘌骨髓瘤细胞：核酸代谢旁路酶缺陷型（次黄嘌呤呤- -鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRTHGPRT- - 或胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷激酶核苷激酶KTKT- -）原生质体融合：将对数期的骨髓瘤细胞与新

10、鲜原生质体融合：将对数期的骨髓瘤细胞与新鲜B B淋巴细胞混合，用淋巴细胞混合，用PEGPEG为诱导剂，进行细胞融合为诱导剂，进行细胞融合在在HATHAT培养基中选择培养培养基中选择培养鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备一、杂交瘤细胞系的建立一、杂交瘤细胞系的建立在在HATHAT培养基中选择培养融合细胞：亲本培养基中选择培养融合细胞：亲本B B细胞不能细胞不能离体培养，离体培养，5-7d5-7d后自行死亡，亲本骨髓瘤细胞是缺后自行死亡，亲本骨髓瘤细胞是缺陷型，在选择培养基上不能生长。只有融合细胞才陷型，在选择培养基上不能生长。只有融合细胞才能正常生长，被筛选出来。培养过程中，检查是否能

11、正常生长，被筛选出来。培养过程中，检查是否污染，隔日换培养液。污染，隔日换培养液。单克隆细胞筛选：对形成的集落，有限次数稀释，单克隆细胞筛选：对形成的集落，有限次数稀释，分离出单个细胞，进行特异性抗体筛选，使其克隆分离出单个细胞，进行特异性抗体筛选，使其克隆化。淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞，从细胞群体中化。淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞，从细胞群体中筛选出遗传性稳定、分泌抗体均一的同源性细胞系，筛选出遗传性稳定、分泌抗体均一的同源性细胞系，建库，保存。建库，保存。鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备二、杂交瘤细胞培养二、杂交瘤细胞培养1 1、体内培养工艺：、体内培养工艺：在小鼠或大鼠腹腔内，

12、杂交瘤生长分泌单克隆抗体在小鼠或大鼠腹腔内，杂交瘤生长分泌单克隆抗体给小鼠注射异十八烷或液体石蜡使致敏，给小鼠注射异十八烷或液体石蜡使致敏，8-10d8-10d后后，向腹腔接种杂交瘤细胞。，向腹腔接种杂交瘤细胞。2-42-4天后腹部涨大，天后腹部涨大，1-21-2周时开始抽取腹水，隔日采集，直至动物死亡。也周时开始抽取腹水，隔日采集，直至动物死亡。也可在最大腹水时处死动物，一次性抽取腹水。可在最大腹水时处死动物，一次性抽取腹水。血清来生产单克隆抗体：杂交瘤细胞皮下植入动物血清来生产单克隆抗体：杂交瘤细胞皮下植入动物体内，一段时间后，出现肿瘤，采血清制备单克隆体内，一段时间后，出现肿瘤，采血清制

13、备单克隆抗体。抗体。鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备多用无血清培养基多用无血清培养基杂交瘤细胞杂交瘤细胞的悬浮培养产生的抗体滴度的悬浮培养产生的抗体滴度较低较低高密度的微囊化培养适合抗体生产，抗体截留高密度的微囊化培养适合抗体生产，抗体截留在微囊内，纯度较高，约在微囊内，纯度较高，约50，有利于分离纯化，有利于分离纯化。二、杂交瘤细胞培养二、杂交瘤细胞培养鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备2、体外培养工艺、体外培养工艺三、单克隆抗体纯化三、单克隆抗体纯化离心离心：除去细胞碎片及脂类等，澄清溶液。加入硅除去细胞碎片及脂类等，澄清溶液。加入硅胶及其他吸附剂，有利于分离。胶及其

14、他吸附剂，有利于分离。沉淀沉淀：用硫酸铵沉淀，获得粗品。用辛酸用硫酸铵沉淀，获得粗品。用辛酸硫酸铵硫酸铵沉淀或硫酸铵沉淀或硫酸铵-DEAE-DEAE离子交换色谱获得单克隆抗体。离子交换色谱获得单克隆抗体。纯纯化化：离子交换、离子交换、Protein A-sephrose 4B Protein A-sephrose 4B 和和Protein G-sephrose 4BProtein G-sephrose 4B亲和层析，羟基磷灰石分亲和层析，羟基磷灰石分离、疏水色谱。离子交换色谱后抗体超度达离、疏水色谱。离子交换色谱后抗体超度达9999，用凝胶过滤等纯化，可用于制备相应的剂型。用凝胶过滤等纯化，可

15、用于制备相应的剂型。鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备鼠源单克隆抗体制备的基本过程鼠源单克隆抗体制备的基本过程鼠源单克隆抗体鼠源单克隆抗体抗体制备抗体制备 人源化抗体人源化抗体 小分子抗体小分子抗体第三节第三节 基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备一、人源化抗体一、人源化抗体基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备1、人鼠嵌合抗体、人鼠嵌合抗体 针对针对鼠源性而鼠源性而进行基因改造，降低进行基因改造，降低或或消除免疫原性，保持或提高亲和力和消除免疫原性，保持或提高亲和力和特异性是改造抗体的二个基本原则。特异性是改造抗体的二个基本原则。 人鼠嵌合抗体：由鼠抗

16、体的可变区和人鼠嵌合抗体：由鼠抗体的可变区和人抗体的稳定区组成，用人人抗体的稳定区组成，用人C C区基因区基因取代鼠取代鼠C C区基因，在空间结构上相对区基因，在空间结构上相对独立，大大降低免疫原性独立，大大降低免疫原性。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备1、人鼠嵌合抗体制备、人鼠嵌合抗体制备 可变区基因的克隆。用杂交瘤细胞的可变区基因的克隆。用杂交瘤细胞的mRNAmRNA为模板，为模板，RT-PCRRT-PCR，克隆，克隆鼠鼠可变区基因。可变区基因。 表达载体的构建。将轻链和重链分别构建成相应的表达载体的构建。将轻链和重链分别构建成相应的表达盒表达盒，连接到同一个高效载体中。连接到同一

17、个高效载体中。 嵌合抗体的表达嵌合抗体的表达与制备与制备。共转染哺乳动物细胞系如。共转染哺乳动物细胞系如CHOCHO和骨髓瘤细胞中和骨髓瘤细胞中，按照动物细胞培养工艺生产按照动物细胞培养工艺生产。缺点：缺点：保留保留3030左右的鼠源序列，左右的鼠源序列，并没有完全消除免疫原性的发生并没有完全消除免疫原性的发生并具有全抗体的缺点。并具有全抗体的缺点。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备2、改型抗体制备、改型抗体制备改型抗体是改型抗体是把鼠把鼠单克隆抗体单克隆抗体的的互互补决定区（补决定区（CDRCDR）移植移植到人单克隆到人单克隆抗体的骨架区，抗体的骨架区，使人单克隆抗体使人单克隆抗体获得

18、同鼠单抗一获得同鼠单抗一样的抗原特异性样的抗原特异性，也也称为称为CDRCDR移植移植抗抗体。体。鼠杂交瘤细胞系鼠杂交瘤细胞系克隆鼠可变区基因并测序克隆鼠可变区基因并测序设计改型人可变区基因设计改型人可变区基因构建人可变区和恒定区基因载体构建人可变区和恒定区基因载体改型抗体改型抗体基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备3、人源化抗体、人源化抗体 人人- -人杂交瘤融合率低、不稳定，用传统杂交瘤人杂交瘤融合率低、不稳定，用传统杂交瘤技术制备高亲和力稳定的人抗体克隆十分困难。技术制备高亲和力稳定的人抗体克隆十分困难。 可以用噬菌体抗体库技术、基因敲出技术、置换可以用噬菌体抗体库技术、基因敲出技术

19、、置换技术、制备完整全人源抗体片段及全抗体技术、制备完整全人源抗体片段及全抗体。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备4、融合抗体、融合抗体 融合抗体是抗体与其他蛋白融合表达的产物，融合抗体是抗体与其他蛋白融合表达的产物，具有具有抗抗体和其他蛋白的双重功能，形成新的生物活性。体和其他蛋白的双重功能，形成新的生物活性。 免疫毒素免疫毒素：抗体与毒性蛋白融合，定向杀伤肿瘤。抗体与毒性蛋白融合，定向杀伤肿瘤。FcFc、FabFab、FvFv等等, ,绿脓杆菌外毒素、白喉毒素等。绿脓杆菌外毒素、白喉毒素等。 免疫毒素只能用大肠杆菌制备免疫毒素只能用大肠杆菌制备 免疫抗体：免疫抗体：抗体片段与细胞因抗

20、体片段与细胞因子子或受体分子或受体分子融合，融合，IL-2/IL-2/IgG1IgG1、TNFRTNFR/ /IgG1IgG1、IFNrRIFNrR/ /IgG1IgG1等等。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备二、小分子抗体二、小分子抗体小分子抗体是分子量较小的具有抗原结合功能的抗小分子抗体是分子量较小的具有抗原结合功能的抗体片段。体片段。优点：可以在大肠杆菌等细胞中原核表达，生产成优点：可以在大肠杆菌等细胞中原核表达，生产成本低；容易穿透血管壁或组织屏障，进入病灶部位本低；容易穿透血管壁或组织屏障，进入病灶部位，有利于治疗肿瘤等；不含有，有利于治疗肿瘤等；不含有FcFc片段，不与片段，

21、不与FcFc受体受体结合；有利于进一步进行基因工程改造。结合；有利于进一步进行基因工程改造。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备Fab制备技术制备技术 FabFab结构：结构：由由VHVH和和CH1CH1和完整轻链（和完整轻链（VLVL和和CLCL）组成，）组成，通过二硫键连接形成异二聚体，其大小只有完整全通过二硫键连接形成异二聚体，其大小只有完整全抗体分子抗体分子1/31/3，仅有一个抗原结合位点。，仅有一个抗原结合位点。 FabFab的制备的制备： 第一条第一条路线：路线：木瓜蛋白酶水解全抗体木瓜蛋白酶水解全抗体 分离纯化制备分离纯化制备FabFab。 第二条第二条路线：路线：基因工程

22、大肠杆菌表达基因工程大肠杆菌表达 第三条第三条路线：基因工程动物细胞表达路线：基因工程动物细胞表达重组重组FabFab抗体。抗体。人源性恒定区，人源性恒定区，H H链的链的V V区和区和CH1CH1区的区的cDNAcDNA与与L L链完整的链完整的cDNAcDNA重组。重组。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备 FvFv由轻链可变区和重链可变区组成，以非共价键由轻链可变区和重链可变区组成，以非共价键结合。可用前导肽引导在基因工程细菌中表达结合。可用前导肽引导在基因工程细菌中表达FvFv的两个片段，分泌进入周质，组装成的两个片段，分泌进入周质，组装成FvFv。 FvFv是非共价键结合，不稳定

23、，应用最多是单链抗是非共价键结合，不稳定，应用最多是单链抗体体ScFvScFv。 VLVL区区cDNA 5cDNA 5端端与与VHVH区区cDNA 3cDNA 3端用端用接头接头连接，构成连接，构成单链可单链可ScFvScFv，大小只有全抗体的，大小只有全抗体的1/61/6。接头长度不。接头长度不短于短于3.5 nm3.5 nm，大多含有，大多含有14141515个氨基酸残基。最个氨基酸残基。最广泛使用的接头是广泛使用的接头是 (GGGGS)3(GGGGS)3。ScFvScFv可在大肠杆菌可在大肠杆菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达，最常、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达，最常用大肠杆菌。用大肠杆菌。 ScFvScFv在在3737时稳定性较差，可在双链之间增加时稳定性较差，可在双链之间增加1 1个个二硫键，提高稳定性，这就是二硫键，提高稳定性，这就是dsFvdsFv。基因工程抗体基因工程抗体抗体制备抗体制备小结与思考题1 1、从抗体的结构出发，分析抗体药物的改从抗体的结构出发，分析抗体药物的改造的途径造的途径。2 2、如何选择、如何选择抗体制备的工艺路线？抗体制备的工艺路线？3 3、分析近年来抗体药物市场需求及其主要分析近年来抗体药物市场需求及其主要技术进步。技术进步。抗体制备工艺抗体制备工艺谢谢！