稳态荧光分析方法与应用进展课件.ppt

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1、The Discovery and Development of the Green Fluorescent Protein,（GFP ）绿色荧光蛋白）绿色荧光蛋白2008诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖Osamu Shimomura 1960sMartin Chalfie 1990sRoger Y. Tsiens, todayhttp:/nobelprize.org分子荧光产生机理-Jablonski Diagram荧光分光光度计结构示意图透射光透射光吸收光谱吸收光谱氙灯氙灯(或高压汞灯）或高压汞灯）（200-800 nm)荧光信号 荧光寿命 荧光光谱 荧光强度随光谱变化 成像（荧光物质在样本中分布

2、的空间信息） 强度 寿命可获得的信息 分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等 分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭 分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等 分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新的荧光峰的产生 分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等一般稳态荧光仪的功能 2D荧光光谱：荧光强度-激发（发射）波长 3D-荧光光谱：激发波长-发射波长-荧光强度 同步荧光光谱（固定Dl）：以一定波长差同时扫描激发和发射单色器，Dl=Stokes位移;荧光强度-激发（发射）波长 共振光散射(固定Dl=

3、0 nm) 荧光偏振技术：平面偏振光激发样品。 荧光动力学方法 导数荧光方法三维荧光分析方法应用 天然与人工处理琥珀的三维荧光光谱天然与人工处理琥珀的三维荧光光谱亓利剑等，宝石和宝石学杂志，2005，7卷，1期，10-16天然琥珀天然琥珀热处理琥珀热处理琥珀热处理琥珀热处理琥珀热填充处理琥珀热填充处理琥珀同步荧光分析方法的应用 恒波长同步荧光分析 多环芳烃和生物大分子的检测 小分子与蛋白相互作用的热力学研究 恒能量同步荧光分析 多环芳烃的检测 可变角同步荧光分析 天然产物检测 高背景体系中微量组分的检测生活污水的同步荧光谱(SFS)研究(lex=248 nm)Wat. Res. Vol. 29

4、, No. 6, pp. 1599-1602, 1995a.Settled sewageb.Final effluenta.Settled sewageb.Final effluentc.Filtered sewagea.Tyrosinb.Cinnamic acidc.Humic acida.Tyrosinb.Humic acidc.Tri-distilled waterFL & UV absorptionFLSFS, D Dl l=20 nmSFS, D Dl l=20 nm280 nm280 nm-carotene在表面活性剂中的同步以及3D荧光光谱40045050055060002004

5、0060080010001200140016001800IFLwavelength / nm 4.55E-4 mol/L 3.62E-4 mol/L 2.74E-4 mol/L 1.10E-4 mol/L 7.12E-5 mol/L 6.25E-5 mol/L 5.37E-5 mol/L 4.49E-5 mol/L niosome membrane phase solvent250300350400450500550250300350400450500550Emission wavelength / nmExcitation wavelength / nm0.500019.8139.1358.

6、4477.7597.06116.4135.7155.02503003504000510152025303540IFLwavelength / nm 2.74E-4 mol/L 2.40E-4 mol/L 2.06E-4 mol/L 1.71E-4 mol/L 1.37E-4 mol/L 1.07E-4 mol/L 6.85E-5 mol/L 3.48E-5 mol/L niosome membrane phase solvent0.005.00 x10-51.00 x10-41.50 x10-42.00 x10-42.50 x10-43.00 x10-40.0001.0002.0003.000

7、4.0005.0006.000Y=0.0701+1.89*104X R=0.998Relative IFLConcentration / mol/Lunpublished results大气样品中对苯二酚与间苯二酚的同步荧光测定Anal Bioanal Chem (2004) 378 : 16481651D Dl l=15 nmOHHOhydroquinoneOHHOresorcinol292/328 nm 275/303 nm共振光散射原理和应用 光散射 共振光散射 LSAbs 1993年Pasternack 等用共振光散射技术研究了卟啉类化合物在核酸上的聚集，首次将该技术应用于分析化学。

8、黄承志等利用光散射技术研究了生物大分子体系的散射光谱。l22021202142064sin216=nnnnrNIaI 金纳米(AuNPs)共振光散射测定糖原AuNPs AuNPs和500 ngmL-1糖原200300400500600700800020004000600080001000002004006008000200040006000800010000RLS IntensityWavelength (nm)B+KAuGnKChSnTalanta 76, 1207-1211, 2008. J. Phys. chem. B (accepted)ChSGChSG ChSG nnnK=共振光散射

9、研究亚甲基蓝(MB)在核酸分子骨架上的组装SNNCH3CH3NHH3CCH3MB在在DNA分子骨架上的组装分子骨架上的组装Huang et al, Bull. Chem. Soc. Jpn, 72, 1501-1508(1999)DNA mg/mLa. 0b. 0.4c.0.8d. 1.2 The RLS spectra pf MB with DNA(pH 8.14)荧光偏振技术(1926年，Perrin) 以平面偏振光激发荧光分子时，静止的荧光分子则发射与入射光相同偏振面的偏振光（各向异性/偏振)。 由于分子存在旋转翻滚运动，发射光的偏振平面与入射光会有差异，产生消偏振。 消偏振 vs 分子运动 大分子(如蛋白质)运动缓慢，发射光偏振度较高。 小分子，旋转与翻滚速度快，发射光有不同程度的消偏振现象。 获得分子的大小以及分子之间相互作用的信息。 免疫分析 激素-受体作用 蛋白-多肽相互作用 DNA-蛋白相互作用以及酪氨酸激酶分析等方面的研究。荧光偏振免疫分析(FPIA)荧光分析法（第三版），荧光分析法（第三版）， 许金钩许金钩 王尊本，王尊本， 科学出版社，科学出版社，2007 荧光分析法荧光分析法稳态荧光稳态荧光时间分辨荧光时间分辨荧光2D荧光3D荧光同步荧光共振光散射脉冲时间分辨频域时间分辨偏振荧光荧光成像荧光动力学， 共振能量转移，