第三章核酸技术课件.ppt

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1、第三章第三章核核 酸酸 技技 术术 核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化核酸电泳核酸电泳染色体染色体DNA电泳电泳 DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制限制酶切反应和限制酶谱绘制 DNA的连接的连接PCR技术技术分子杂交技术分子杂交技术 核酸序列的测定核酸序列的测定第一节第一节核酸的分离和纯化核酸的分离和纯化 一、一般程序一、一般程序 1、供体的核酸分离、供体的核酸分离 供体细胞培养供体细胞培养 收集收集(菌体菌体)细胞细胞 细胞破碎细胞破碎 分离分离总总DNA 分离细胞器分离细胞器 分离分离总总RNA 分离分离细胞器细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性特异性RNA 染色体染色体DNA(

2、组建基因组文库组建基因组文库) 2、载体、载体DNA分离分离 载体载体DNA 感染或转染细胞（病毒型）感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型）转化细菌细胞（质粒型） 分离病毒颗粒分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体培养转化细胞、收集菌体 病毒载体病毒载体DNA分离与纯化分离与纯化 破碎细胞破碎细胞 质粒质粒DNA分离与纯化分离与纯化 3、DNA片段的分离片段的分离 DNA 限制酶切限制酶切 凝胶电泳分离凝胶电泳分离 特定特定DNA片段的回收片段的回收 4、质量评估、质量评估 1） 凝胶电泳凝胶电泳 2）光密度值测定）光密度值测定 3）限制酶切分析）限制酶切分析二、细胞裂解二、细胞裂解

3、1. 酶法：酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等等 3) 丝状真菌：丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶、溶壁酶、纤维素酶 4) 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。足酶的

4、最佳反应条件。 2. 机械法机械法 1) 压力剪切法：压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和和G+球菌除外）球菌除外） 2)射击破碎法：射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（破碎机，搅切器（blender），混合），混合器（器（mixer），），0.1-0.45mm玻璃球玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.10.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法反复冻融法 三、三、DNA的分离与纯化的分离与纯化 1、供体、供体DNA的分离与纯化的分离与纯化 要

5、求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1) 基因组大小：基因组大小： 染色体染色体细菌细菌 33004200kb酵母酵母 15,000 kb果蝇果蝇 1.28x105 kb人人 3x106 kb植物植物 2x1051x108 kb 天花病毒天花病毒 288 kb痘病毒痘病毒 196 kb质体质体 几几100以上以上kb 线粒体线粒体 藻类藻类 线状线状 15kb酵母酵母 环状环状 1978 kb植物植物 环状环状 100150 kb动物动物(扁虫到人扁虫到人)环状环状 1518 kb锥虫锥虫 网状网状 6000 kb(幼体幼体)短膜虫短膜虫 网

6、状网状 30,000 kb(幼体幼体) (Kinetoplast） 叶绿体叶绿体双子叶植物双子叶植物 121（菠菜）（菠菜）154kb（豌豆）（豌豆）单子叶植物单子叶植物 151（玉米）（玉米）182kb（浮萍）（浮萍）藻类藻类 132（裸藻）（裸藻）191kb（衣藻）（衣藻） 1) DNA分离纯化过程分离纯化过程 破碎细胞破碎细胞 + DNA抽提液抽提液(EDTA、去污剂、还原剂、去污剂、还原剂) 65温育温育20 冰浴冷却冰浴冷却 离心去细胞碎片离心去细胞碎片 苯酚抽提法苯酚抽提法 CsCl密度梯度离心密度梯度离心 1) 苯酚抽提法苯酚抽提法上清液上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提缓冲液用水饱

7、和苯酚抽提23次次 上层液相用氯仿抽上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉沉淀物用淀物用70%冷乙醇洗涤冷乙醇洗涤,干燥干燥 溶于缓冲液溶于缓冲液 加入加入RNAase处理处理除去除去RNA 苯酚氯仿抽提苯酚氯仿抽提 沉淀干燥沉淀干燥 2) CsCl密度梯度离心密度梯度离心上清液上清液 加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液 室温下超速离心室温下超速离心(45,000rpm）16小时小时 穿孔取出穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提异丙醇抽提溴乙锭溴乙锭 缓冲液透析除去残余缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积

8、冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥离心、洗涤、干燥 *两种方法比较：两种方法比较： CsCl法操作步骤少，分离法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速分子量大，耗财多，且需超速离心机。离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分分子断裂。子断裂。 若若 小心操作，所获小心操作，所获DNA亦符合要求。亦符合要求。 * 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液

9、。. 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心. 使使RNA分离：分离：RNase处理或超速离心处理或超速离心. 使使DNA与其它可溶物分离与其它可溶物分离 2. 载体载体DNA的分离与纯化的分离与纯化 1) 质粒载体质粒载体DNA的分离的分离 关键关键：如何使质粒：如何使质粒DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA分开分开 原理原理：质粒：质粒DNA比染色体比染色体DNA 小得多，在小得多，在DNA抽提过程中，抽提过程中，染色体染色体DNA断裂成小片段断裂成小片段(线状线状)，质粒，质粒DNA仍保持超螺旋构型仍保持超螺旋构型 3) 细胞器细胞器DNA的分离的分离 植物组织

10、植物组织 用核分离缓冲液匀浆用核分离缓冲液匀浆 过滤过滤 滤液离心滤液离心(2000g, 10,4) 核缓冲液使核裂解核缓冲液使核裂解(含含0.5%Triton X-100) 抽提抽提DNA 植物组织植物组织 细胞器缓冲液匀浆细胞器缓冲液匀浆 离心离心(100g, 10,4)除去细胞除去细胞核核 离心离心(1800g, 10,4)分离叶绿体分离叶绿体 离心离心(10,000g, 10,4)分离线粒体分离线粒体 DNase除去细胞器外除去细胞器外DNA 加入加入EDTA使使DNase失活失活 纯化细胞器纯化细胞器 细胞器裂解细胞器裂解 提取提取DNA 方法：方法： . 超速离心：利用两种超速离心

11、：利用两种DNA分子的大小和空间构型分子的大小和空间构型 . 变性法：在变性条件下使染色体变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于上述方法亦可用于ss环状病毒环状病毒DNA RF型的分离型的分离, 质粒质粒DNA的的氯霉氯霉素扩增素扩增使用并不广泛（菌株和载体）使用并不广泛（菌株和载体） 2) 噬菌体载体噬菌体载

12、体DNA的分离的分离 纯净病毒颗粒纯净病毒颗粒 病毒载体病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒载体可采用质粒DNA的分离方法的分离方法 二、二、RNA的分离与纯化的分离与纯化 1. 制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用 1) RNase的特点：抗酸抗碱的特点：抗酸抗碱,具很广具很广pH作用范围作用范围; 抗高温严抗高温严寒寒(065均具活性）；抗变性剂均具活性）；抗变性剂 2) 解决办法：外源解决办法：外源RNase高温，焦磷酸二乙酯高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理处理所有溶液（所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套除外）和器皿，操作者带手套 内

13、源内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶抑制剂，蛋白酶K等等 2. 总总RNA的制备的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）含量很高的组织（胰脏）中提取中提取RNA特别有效，可使特别有效，可使RNase迅速变性，制备的迅速变性，制备的RNA有较有较高翻译活性。在

14、高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。行的。3. 多聚核糖体多聚核糖体RNA的制备的制备 1) 多聚核糖体的分离多聚核糖体的分离 超速离心法（超速离心法（30-40万万g，离心，离心2-3 h） 镁盐沉淀法（镁盐沉淀法（0.1 M Mg+） 分级分离法分级分离法分离特异性多聚核糖体分离特异性多聚核糖体 i. 结合与游离核糖体结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。 ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体多聚

15、核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法核糖体免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法直接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+抗体抗体 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 * * *间接免疫沉淀法间接免疫沉淀法 新生肽链新生肽链+ +抗体抗体+ +抗抗- -抗体（二抗）抗体（二抗） 不可不可 溶复合物溶复合物 离心分离离心分离 *免疫亲和层析法免疫亲和层析法 新生肽链新生肽链-抗体复合物抗体复合物 不溶性交联抗原基不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附质亲和层析柱吸附 洗脱洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的的mRNA，但必须使，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶用高

16、纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶 2) 多聚核糖体多聚核糖体RNA的分离的分离纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提苯酚抽提 4. RNA的分级分离的分级分离 1) 分子量大小分级分离分子量大小分级分离 i. 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳凝胶电泳 2) 核酸序列分级分离核酸序列分级分离 i. 分子杂交法：适用于同源性很高的分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离的分离DNA分子变性分子变性 结合到结合到NCF RNADNA杂交杂交 洗涤洗涤 洗膜洗膜 乙醇沉淀乙醇沉淀 ii. 亲和层析法：亲和层析法：

17、低聚低聚dT纤维素纤维素: 用于用于poly(A)较长的较长的mRNA； 多聚多聚U琼脂糖琼脂糖: 用于用于poly(A)较短的较短的mRNA（20A） RNA进样吸附进样吸附 洗涤洗涤 洗脱洗脱 收集收集260nm处吸收峰样品处吸收峰样品 乙醇沉淀乙醇沉淀 iii. 无无poly(A) mRNA的分离的分离 纯化多聚核糖体纯化多聚核糖体 核糖体亚基核糖体亚基+mRNP 离心离心 mRNP 蛋白酶蛋白酶K mRNA 低聚（低聚（dT）纤维素层析）纤维素层析 洗出液洗出液 乙醇沉淀（无多乙醇沉淀（无多聚聚A mRNA） 5. RNA的质量评估方法的质量评估方法 1) 光密度值测定法光密度值测定法

18、 A260/A280=2.0 2) 凝胶电泳凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译体外蛋白质翻译细胞裂解物细胞裂解物 胍盐法胍盐法 总总RNA 分子杂交法分子杂交法 特异特异RNA分子分子 热苯酚法热苯酚法 凝胶电泳凝胶电泳 围围RNA大小分级分离大小分级分离 大小范大小范蔗糖密度蔗糖密度梯度离心梯度离心 一定一定 LiCl/ 核酸序列核酸序列 尿素法尿素法离心离心 分级分离分级分离 亲和层析法亲和层析法 poly（A）RNA分子分子 高速离心法高速离心法 全部多聚核糖体全部多聚核糖体 上清液上清液 镁盐沉淀法镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心结合与结合与游离多聚核糖体游离多聚核糖体分级分离法

19、分级分离法 蔗糖连续密度蔗糖连续密度一定范围大小核糖体一定范围大小核糖体多聚核糖体多聚核糖体RNA免疫沉淀法免疫沉淀法特异性多聚核糖体特异性多聚核糖体 第二节第二节核核 酸酸 电电 泳泳 1. 种类种类 1) 按凝胶材料分按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼普通琼脂糖和低熔点琼脂糖脂糖和低熔点琼脂糖) 2) 按电泳装置分按电泳装置分: 水平式水平式/琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶; 竖式竖式/聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易操作难易 2. 用途用途 琼脂糖凝胶用于琼脂糖凝胶用于

20、DNA和和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。常用于小分子核酸分析。 3. 凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序 制胶制胶 点样点样 电泳电泳 染色染色 观察观察二、二、DNA电泳电泳 1. DNA分子种类分子种类 1) 线状线状DNA单链与双链，单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形电泳时要注意局部区域形成成ds-DNA，造成迁移距离不确定，造成迁移距离不确定 2) 环状环状DNA单链（如单链（如M13mp）和双链（质粒）和双链（质粒DNA） 3) 线状线状ds-DNA电泳电泳使用频率最高的一种电泳使用频率最高的一种电泳 这类这类DNA分子

21、在电泳过程中迁移的距离受以下几个因分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：素的影响： i. 分子量分子量 的大小的大小: 迁移距离与分子量的迁移距离与分子量的常用对数常用对数成反比成反比 ii. 凝胶浓度凝胶浓度: 浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNAiii.电压电压: 低电压时，迁移率与低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，电压成正比；电压增高时，不同大小不同大小DNA片段迁移率片段迁移率增大是不同的。增大是不同的。iv.碱基组成与温度碱基组成与

22、温度: 不受影响不受影响,温度高可导致温度高可导致DNA带变形带变形或解链。或解链。4) 环状环状ds-DNA电泳电泳: 常用于质粒常用于质粒DNA的初步鉴定的初步鉴定5) 线状线状ss-DNA电泳电泳 链分离凝胶链分离凝胶：化学定序时，用于单链分离。：化学定序时，用于单链分离。DNA双链互补，双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。变性双链，两条单链。 核酸定序凝胶核酸定序凝胶( (染料指染料指示剂示剂) )：为避免局部区域：为避免局部区域产生二级结构，可采用各产生二级结构，可采用各种变性措施，

23、如煮沸样品，种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）甲胺等）三三. RNA凝胶电泳凝胶电泳 方法：不同的方法：不同的RNA电泳方法是依据使电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。而且在整个电泳过程中也保持一级结构。 1. 乙二醛乙二醛/二甲基亚砜法二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形

24、成一个稳定的附加环，从而阻止鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补碱基的互补作用发生作用发生 步骤：步骤：RNA+10mM羟甲基醛和羟甲基醛和50% DMSO混合混合 50、1 h变性变性 点样点样 电泳电泳 染色染色 观察观察 2. 羟甲基汞法羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤：步骤：RNA+10mM羟甲基醛羟甲基醛 点样在含点样在含4mM羟甲基醛的羟甲基醛的琼脂糖凝胶上琼脂糖凝胶上 电泳电泳 染色观察染色观察 3. 甲醛法甲醛法

25、 步骤：步骤：RNA+2.2M甲醛甲醛+50%甲胺甲胺 点样在含点样在含2.2M甲醛琼脂甲醛琼脂糖凝胶上糖凝胶上 MOPS缓冲液电泳缓冲液电泳 染色观察染色观察 其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳电泳. 4. 三种方法的比较三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两

26、种变性剂有毒。有毒。五、蛋白质电泳五、蛋白质电泳 方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）于酶促反应（颜色变化） SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻翻译产物，基因表达产物测定等。译产物，基因表达产物测定等。 五、核酸片段的分离与回收五、核酸片段的分离与回收 1.方法方法 用于用于DNA、RN

27、A以及蛋白质的回收以及蛋白质的回收 1) 电洗脱法电洗脱法: 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；介质中； 2) 滤纸法滤纸法 核酸凝胶染色核酸凝胶染色 长波紫外光确定位置长波紫外光确定位置 在分在分离带前方切一口子并插入滤纸条离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜其背面覆盖透析袋膜) 电泳至电泳至DNA带全部进入滤纸条带全部进入滤纸条 洗脱洗脱DNA 纯化、沉淀纯化、沉淀 3) 透析袋法透析袋法切下含切下含DNA带琼脂块带琼脂块 放入透析袋，封口放入透析袋，封口 放入电泳槽放入电泳槽 电泳电泳23小时至全部小时至全部DNA离开凝胶

28、块离开凝胶块 反向电泳反向电泳1分钟分钟 取出取出DNA液液 纯化、沉淀纯化、沉淀 4) 冻融法冻融法 5) 酶解法酶解法 待回收待回收DNA 切口切口 DNA 切口切口 凝胶块凝胶块 滤纸法滤纸法 透析袋透析袋 凝胶块凝胶块 待回收待回收DNA DNA 透析袋法透析袋法 待回收待回收DNA 凝胶块凝胶块 V-型槽型槽 电洗脱槽法电洗脱槽法 回收回收DNA方法方法 2. 影响回收率的因素影响回收率的因素 1）DNA分子大小分子大小回收率与分子量大小呈负相关；回收率与分子量大小呈负相关； 2）乙醇沉淀）乙醇沉淀其中温度、时间和其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）浓度（回收时体积）均与回收率有

29、关；均与回收率有关； 3）离心时间）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其尤其明显。明显。3. 回收回收DNA片段质量片段质量 凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐 沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、盐、核苷酸、盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。聚丙烯酰胺及蛋白质等。第三节第三节 染色体染色体DNA电泳电泳一、一、 DNA分子在凝胶电泳中的移动分子在凝胶电泳中的移动 1、常规电泳、常规电泳 在自由电场中，在自由电场中，DNA的移动速度与分子量大小无关；的移动速度与分子量大小无关； 将将DN

30、A分子置于凝胶中进行电泳，分子置于凝胶中进行电泳，DNA移动距离与分子量有关。移动距离与分子量有关。分子量小的移动快；反之则慢。大于分子量小的移动快；反之则慢。大于20kb的的DNA大分子，其移动大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。率也就消失了。 2、脉冲场凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE) PFG工作假说工作假说 1

31、) DNA松弛时间：大分子松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（分子量呈正相关（Tr） 2) DNA移动时间：移动时间：DNA分子向前移动的时间（分子向前移动的时间（Tm） 3) 电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp） 分子量大的分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。分子量大的用于向

32、前运动的时间少，移动随分子量大小而变化。分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。这就是使不同大小分子量这就是使不同大小分子量DNA分离的假说。分离的假说。 Tp小小 = Tm小小+ Tr小小 Tp大大 = Tm大大+ Tr大大因因Tp小小 = Tp大大 ， Tr小小 Tm大大 ，所以，所以， S小小 S大大 显然，要使一个显然，要使一个DNA样品中不同大小的样品中不同大小的DNA分子分离，脉冲分子分离，脉冲时间应选在最大时间应选在最大DNA分子所需的上限。分子所需的上限。二脉冲场凝胶电泳

33、的种类二脉冲场凝胶电泳的种类 1正交场脉冲凝胶电泳（正交场脉冲凝胶电泳（OFAGE） 利用两个或多个交变电场，使利用两个或多个交变电场，使200-3000 kb的的DNA分子发生分分子发生分离，其电极排列可以是双向非均匀，单向非均匀等。离，其电极排列可以是双向非均匀，单向非均匀等。脉冲场凝胶电泳原理图脉冲场凝胶电泳原理图 北北 南南 脉冲场电泳脉冲场电泳 常规电泳常规电泳 两组电极，排列不均匀两组电极，排列不均匀; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向，定时改变电场方向，DNA分子的净分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动

34、方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈移动方向与两电场呈45o，在电泳过，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，品增加， 制备制备DNA样品与常规方法样品与常规方法不同不同 2. 场倒置凝胶电泳场倒置凝胶电泳（FIGE） 利用常规电泳槽进行电泳，但电场方向则是周期性地发生倒利用常规电泳槽进行电泳，但电场方向则是周期性地发生倒置，其正向和反向的脉冲时间长度之比为置，其正向和反向的脉冲时间长度之比为3或其它比值。该法可或其它比值。该法可使使15-700 Kb或以上的或以上的DN

35、A分子发生分离。分子发生分离。 为了克服同移动现象产生（即不同大小为了克服同移动现象产生（即不同大小DNA分子一起移动），分子一起移动），可以采用可以采用转换时间递增法转换时间递增法（swiching-interval ramps）, 即由电泳即由电泳开始时的短脉冲时间逐渐递增到电泳结束时的长脉冲时间。如开开始时的短脉冲时间逐渐递增到电泳结束时的长脉冲时间。如开始时为始时为60：20，结束时可为，结束时可为180：60。 上述两种方法也可联合使用，使一些很难分开的大分子上述两种方法也可联合使用，使一些很难分开的大分子DNA分离。分离。 3. CHEF(Contour-Clamped Homog

36、eneous Electric Fields) 动态调控闭合均一电场电泳动态调控闭合均一电场电泳场倒置电泳场倒置电泳 CHEF(动态调控动态调控闭合均一电场电泳闭合均一电场电泳)各种脉冲场凝胶电泳技术的比较各种脉冲场凝胶电泳技术的比较 方法方法 染色体带染色体带 最大带最大带 最小带最小带 动态调节动态调节 直道直道 均匀电场均匀电场 液体样品液体样品 机械转换机械转换CHEF 15 12000kb 88 bp 是是 是是 是是 是是 不不OFAGE 13 9000kb 5000 bp 不不 不不 不不 是是 不不 TAFE 13 9000kb 2000 bp 不不 是是 不不 不不 不不FI

37、GE 11 2000kb 200 bp 不不 是是 是是 是是 不不RFGE 15 ? 200000 bp 不不 是是 是是 不不 是是三影响染色体三影响染色体DNA电泳的主要因素电泳的主要因素 1染色体的结构染色体的结构 2电泳槽电极的构型电泳槽电极的构型 3电压：它与脉冲时间成反比电压：它与脉冲时间成反比 4脉冲时间脉冲时间：经过实验选择适合于某种生物染色体经过实验选择适合于某种生物染色体DNA完完 全分离的最佳脉冲时间全分离的最佳脉冲时间 5其它因素其它因素：温度，离子强度等：温度，离子强度等四染色体四染色体DNA样品的制备样品的制备 染色体染色体DNA电泳的关键之一是获得完整的电泳的关

38、键之一是获得完整的DNA分子，其制备分子，其制备方法有：方法有： 1固体块法固体块法细胞培养，收集，洗涤，细胞悬液细胞培养，收集，洗涤，细胞悬液 与细胞壁裂解酶液和低熔与细胞壁裂解酶液和低熔点琼脂糖凝胶混合点琼脂糖凝胶混合 倒平板倒平板 复盖裂解酶缓冲液复盖裂解酶缓冲液 细胞壁裂细胞壁裂解过夜解过夜 除去缓冲液除去缓冲液 加入去污剂和蛋白酶加入去污剂和蛋白酶K 反应过夜反应过夜 换换0.5MEDTA，4保存保存 2微球法微球法 制备细胞悬液制备细胞悬液 与石蜡油和低熔点琼脂糖凝胶迅速混合，与石蜡油和低熔点琼脂糖凝胶迅速混合，形成小球形成小球 冰浴迅速冷却冰浴迅速冷却 离心，洗涤离心，洗涤 加入

39、原生质加入原生质体形成液，体形成液，37反应至细胞壁裂解反应至细胞壁裂解 加入裂解液加入裂解液 50 1 h 离心，小球保存于离心，小球保存于0.5M EDTA，4 3加样加样 切一小块样品凝胶块或吸取适量微球，置于电泳用凝胶块的切一小块样品凝胶块或吸取适量微球，置于电泳用凝胶块的样品孔中，用少许低熔点琼脂糖凝胶使样品与整块凝胶为一样品孔中，用少许低熔点琼脂糖凝胶使样品与整块凝胶为一体，每一样品孔应含体，每一样品孔应含0.1-5g DNA样品样品 4. 限制酶切限制酶切 加样前取适量样品，置于加样前取适量样品，置于EP管中，加限制酶缓冲液和限制酶管中，加限制酶缓冲液和限制酶进行酶切进行酶切五染

40、色体五染色体DNA电泳的用途电泳的用途 1. 测定染色体数目测定染色体数目：特别适合于低等真核生物：特别适合于低等真核生物 2. 测定基因连锁关系测定基因连锁关系：结合：结合DNA杂交技术，可适合于各种生杂交技术，可适合于各种生物物 3. 染色体染色体DNA重排分析重排分析 1）酵母细胞经）酵母细胞经X-射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。射线照射，染色体发生断裂，可得弥散型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化带型变化 2）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4. 疾病的诊断疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物引起某种皮肤病的原生动物Leishmania, 具有其特征性的染具有其特征性的染色体。色体。PFG便可用于诊断。便可用于诊断。