荧光定量PCR技术专题课件.ppt

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1、荧光定量荧光定量PCR仪技术仪技术内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1实验方案的选择及实验方案的选择及SYBR法实验流程法实验流程1荧光定量产品选择指南荧光定量产品选择指南荧光定量荧光定量PCR技术：技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规与常规 PCR技术比较：技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义同一

2、个样品重复96次起点定量与终点定量终点定量起点定量l 起始起始DNA量是样本中本来的量，更有意义；量是样本中本来的量，更有意义；终点终点DNA量经过量经过PCR “加工加工”，不是研究所需要的数据，不是研究所需要的数据l 起点定量误差小，终点定量误差大起点定量误差小，终点定量误差大+ 扩增曲线扩增曲线+ 荧光阈值荧光阈值+ Ct值值荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase平台期平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线Cycle（循环数）（循环数）Rn

3、（荧光强度）（荧光强度）BaselineLgliner phase1 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）1 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍1 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段1 真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光阈值荧光阈值平台期平台期荧光阈值荧光阈值基线范围阈 值标准偏差基线信号的标准偏差 x 10Ct值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）（循环数）Rn（荧光强度）（荧光强度）Ct valu

4、e 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值CtCt值值荧光信号有统计学意义显著增长荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线即穿过阈值线)时的循时的循环次数环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数Ct值半对数图谱Ct值线性图谱横轴：横轴：PCR反应循环数反应循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点：值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性值的重现性CT值基 线阈 值基线调整规则如果Ct值 18，不需调整，使用自动分析结果如果Ct值 18 18，使用自动分析结果，出报告，使用自动分析结果，出报

5、告3.3. 如果有如果有C Ct t值值1818，根据，根据 最小的最小的C Ct t值值-4-4修改基线修改基线终点终点，重新分析数据，重新分析数据手工数据分析方法手工数据分析方法理想的PCR反应XnX0 2n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理非理想的PCR反应XnX0 （1En）n*Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量X0 ：起始模板数量：起始模板数量n：扩增循环数：扩增循环数En：扩增效率：扩增效率荧光定量荧光定量PCR

6、原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCtX0 （1En）CtM （1）*XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2）整理方程式（2）：Log2X0 Log 2M Ct Log2（1En）荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理Cycle numberCk 104Ck 102SampleLg of DNA concentration0 模板DNA

7、量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。0 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系CtCt值与模板起始量的关系值与模板起始量的关系Ct值lg 起始DNA浓度CT = - k lgX0 + b标准曲线方法标准曲线方法标 准 品未知样本未知样本PCRPCR方程只在指数期成立方程只在指数期成立循环数循环数线性增长期平台期y = x(1+e)n指数增长期指数增长期Ct值和阈值必须位于指数增长阶段内值和阈值必须位于指数增长阶段内线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认No templat

8、e controlNo template control确认确认标准曲线斜率标准曲线斜率: -3 : -3 -3.5-3.535Cycles35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增35 Cycles35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生相关系数（相关系数（R R2 2）：大于）：大于0.980.98荧光定量荧光定量PCR反应性的确认反应性的确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）:0.9-1.2:0.9-1.2内容概要内容概要1荧光定量

9、荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1实验方案的选择及实验方案的选择及SYBR法实验流程法实验流程1荧光定量产品选择指南荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记非特异性荧光标记 SYBR Green I SYBR Green 特异性荧光标记特异性荧光标记 TaqMan Probe常用荧光标记方法常用荧光标记方法荧光染料法荧光染料法原理原理 目前常用的荧光染料有SYBR Green、SYBR Green、SYTO9、HRM等。其共同性质为：（a）结合于双链核酸的小沟处（b）与双链DNA结合后受激产生荧光（c）在变性条件下双链分

10、开，荧光消失荧光染料法荧光染料法作用机理作用机理问题点：问题点： 荧光染料与双链荧光染料与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。从而可能导致检测结果不准确。荧光染料法荧光染料法问题点与关键点问题点与关键点关键点：关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！设计合适引物，防止非特异性扩增！ 使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCR反应的进行，双链PCR产物呈指数增长，SYBR Green/与双链PCR产物结

11、合后荧光越来越强，当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCR产物进行缓慢加热，从50一直加热到99，在此过程中PCR产物按照TM值的大小双链被依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：荧光染料法荧光染料法融解曲线融解曲线原始图谱原始图谱导数图谱导数图谱荧光染料法荧光染料法融解曲线融解曲线融解曲线分析，单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂峰融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确光，因此定量不准确只有染料法才需要做熔解曲线只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要探针法没有必要双链核

12、酸的熔解曲线分析双链核酸的熔解曲线分析 熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的TM值。核酸双链的TM值由双链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TM值也不同，所以通过熔解曲线，能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。% 成本成本低低，不必设计复杂探不必设计复杂探针针% 适合初步筛查适合初步筛查：先先用用SYBRSYBR筛查，筛查，再用再用探针探针法精确定量少法精确定量少数关键样品数关键样品%熔解曲线：熔解曲线：鉴定鉴定PCRPCR有无杂有无杂带带、引物二聚体、

13、引物二聚体优优 点点% 无模板特异性：无模板特异性：不能分辨主带不能分辨主带与杂带，给出的是总信号与杂带，给出的是总信号% 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高% 不能进行多重定量：不能进行多重定量：每孔只能每孔只能检测一个目标基因检测一个目标基因% 灵敏度相对较低：灵敏度相对较低：适合于适合于5000 拷贝拷贝以上的基因定量以上的基因定量缺缺 点点荧光染料法荧光染料法优缺点优缺点Taqman探针法探针法原理原理+ 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 + 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)+ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光，

14、 R与Q分开，发荧光+ Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,荧光产生。Taqman探针法探针法工作机理工作机理1、引物、探针的设计：、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20s 60，30-60s（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：100-900nM 探

15、针浓度：50-300nM4、其他与常规、其他与常规PCR相同相同Taqman探针法探针法PCR体系的建立体系的建立% 高度特异性高度特异性% 重复性好重复性好% 灵敏度高灵敏度高% 可进行多重定量可进行多重定量优优 点点% 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标% 委托公司标记，价格较高委托公司标记，价格较高% 不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针缺缺 点点Taqman探针法探针法优缺点优缺点+ 标记荧光的发夹探针 + 环与目标序列互补+ 茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的分类的分类分子信标分子信标FRET实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的分

16、类的分类分子信标分子信标+高特异性：对目标序列+ 检测SNP最灵敏的试剂之一+荧光背景低优 点+ 只能用于一个特定目标+ 设计困难+ 价格比较高缺 点实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的分类的分类分子信标分子信标 几种方法的应用比较几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBR Green 染料法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan 方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断Molecular Beacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合

17、特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析. 定性分析研究：定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等. 绝对定量研究：绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等. 相对定量研究：相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认， 差异显示结果验证等荧光定量荧光定量PCR技术的应用技术的应用内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1实验方案的选择及实验方案的选择及SYBR法实验流程法实验流程1荧光定量产品选择指南荧光定量产品选择指南 绝对定量解析方法绝对定量

18、解析方法Sample25绝对定量的定义绝对定量的定义0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系0 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。绝对定量分析几要素绝对定量分析几要素拷贝数的计算：拷贝数的计算：待测样

19、本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014 倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 相对定量解析方法相对定量解析方法相对定量分析方法相对定量分析方法比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：关注点：

20、基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 内参基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。 一组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析几要素相对定量分析几要素P P P P P P O O 根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细

21、胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量PCRPCR，先以，先以CTCT值值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，分析所得的比值，找出比最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。 双标准曲线法双标准曲线法 2 -Ct法法 相对值相对值= =校正值校正值= =目的基因定量结果目的基因定量结果内参基因定量结果内参基因定

22、量结果待测样品的校正值待测样品的校正值对照样品的校正值对照样品的校正值公式：公式：优点：分析简单，实验优化相对简单优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需对目的基因和内参基因做标缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需对目的基因和内参基因做标准曲线准曲线应用：该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。应用：该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。检测样品检测样品内参基因内参基因H H目的基因目的基因X X定量结果定量结果定量结定量结果果校正值校正值相对量相对量对照样品对照样品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.000

23、1.000待测样品待测样品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待测样品待测样品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874实验数据实验数据公式：公式：F = 22 2Ct 法法 前提条件：目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为前提条件：目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1 1，在试验，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于

24、0.10.1，就可以用该方，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。 应用：特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。应用：特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。 待测组目的基因平均Ct值待测组内参基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组内参基因平均Ct值内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1实验方案的选择及实验方案的选择及SYBR法实验流程法实验流程1荧光定量产品选择指南荧光定量产品选择指南一、实验方案

25、的选择一、实验方案的选择荧光定量荧光定量PCR实验方案实验方案荧光染料法荧光染料法Taqman探针法探针法双标准曲线法双标准曲线法2 -Ct法法双标准曲线法双标准曲线法2 -Ct法法 荧光定量荧光定量PCRPCR实验方案的选择实验方案的选择n（1 1）染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析的基因）染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。n（2 2）探针法适合常被用作基因含量的精确检测）探针法适合常被用作基因含量的精确检测( (精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝) )及基

26、因及基因表达变化的精确分析（精确度可达表达变化的精确分析（精确度可达0.10.1倍的变化）。倍的变化）。n（3 3）双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求较高的）双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求较高的实验。实验。n（4 4）2 2 - -CtCt法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基因种类相法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基因种类相对较多的实验。对较多的实验。n根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、经费情况等根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、经费情况等来选择合适的实验方案。来选择合

27、适的实验方案。二、二、SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项样品制备样品制备定量体系配备定量体系配备引物设计引物设计反应条件优化反应条件优化浓度确定浓度确定技能要求技能要求环境要求环境要求误差控制误差控制数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍RT上机上机反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择分析方法分析方法样品制备样品制备环境要求环境要求定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析RT上机上机浓度确定浓度确定SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具分光光度计检测电泳检测RT反应体系优化反应体系优化试剂选择试剂选择样品制备

28、样品制备定量体系配备定量体系配备数据分析数据分析上机上机AMVM-MLVQuant下游反应数确定反转录体积引物的选择SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项定量体系配备定量体系配备引物设计引物设计浓度确定浓度确定环境要求环境要求误差控制误差控制RT样品制备样品制备数据分析数据分析上机上机核酸制备区反应液制备区制作标准曲线设定浓度区间使用mix降低系统误差设置重复（3次）设置空白和阴性对照GC：5060Tm：5065单个碱基重复4个无二级结构扩增长度：100200bp反应体系优化反应体系优化上机上机反应条件优化反应条件优化RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析退火温度优化：

29、梯度PCR延伸时间：产物长度决定反应体积5ul，推荐2050ul引物浓度优化，模板量优化Mg2调节，酶活调节扩增效率：90110重复性：std0.2标准曲线：R0.99或R2 0.98SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项标准品待测样本阳性对照阴性对照技能要求技能要求误差控制误差控制仪器介绍仪器介绍上机上机试剂选择试剂选择RT样品制备样品制备模板准备模板准备数据分析数据分析自配realmastermixRCHO-Lightcycler seriesROTOGEN-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene serie

30、s分装控制内参控制机器校正控制SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍分析方法分析方法上机上机RT样品制备样品制备模板准备模板准备相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项ABI 7500ABI StepOneRoche Lightcycler 1.5Roche Lightcycler 480 Corbett Rotor-gene3000 Corbett Rotor-gene6000 Bio-rad MiniOpticon 杭州博日LINE-GENE FQD-66A Bio-rad iQ5Cepheid Sma

31、rtCycler内容概要内容概要1荧光定量荧光定量PCR的原理的原理1荧光定量荧光定量PCR的标记方法的标记方法1荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法1实验方案的选择及实验方案的选择及SYBR法实验流程法实验流程1荧光定量产品选择指南荧光定量产品选择指南 荧光定量产品荧光定量产品SYBR Green法法探针法探针法FP203RealMasterMix (Probe) 以以DNA为模板为模板FP202 RealMasterMix （SYBR Green） 以以RNA为模板为模板FP302 Quant qRT-PCR(SYBR Green) KitFP303 Quant 一步法一步法qRTPCR (SYBR Green）