第三章-基因工程常用的克隆载体课件.ppt

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1、v载体的功能载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件v第一节第一节 质粒载体质粒载体一、质粒的定义一、质粒的定义 存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能自主自主复制复制的遗传成分的遗传成分（复制子）（复制子）复制子复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位染色体染色体DNA质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA质粒质粒DNADNA编码的表型编码的表型v

2、 抗性特性抗性特性 抗生素抗性：抗生素抗性： 重金属抗性：重金属抗性： 毒性阴离子：毒性阴离子： 其他：其他： Ampr Cmlr Kanr Strr TetrHg、Ni、Co、Pd、Zn砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐嵌入试剂（嵌入试剂（EB、吖啶）、辐射、噬菌体、吖啶）、辐射、噬菌体v 代谢特性：代谢特性：v 修饰寄主生活方式：修饰寄主生活方式： 植物冠瘿病、发根病植物冠瘿病、发根病冠瘿碱代谢冠瘿碱代谢二、质粒二、质粒DNADNA分子的特性分子的特性v结构特性结构特性SC型型 共价闭合环形共价闭合环形DNA（cccDNA，covalently closed

3、circular DNA ）OC型型 开环开环DNA（ocDNA，open circular DNA ） L 型型 线性线性DNA（L-DNA，line DNA）v染料结合特性：染料结合特性： 呈平面结构的染料（呈平面结构的染料（EB）可平嵌入）可平嵌入DNA双链碱基对之间。双链碱基对之间。cccDNA由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料EB分子比分子比L-DNA少，因此密度少，因此密度较大。较大。提取纯化质粒提取纯化质粒DNA：氯化铯氯化铯- -溴乙溴乙锭锭密度梯度离心密度梯度离心法法（CsCl-EtBrCsCl-EtBr）质粒质粒DNADNA纯度高、

4、周期长、纯度高、周期长、设备要求高、存在溴乙锭污设备要求高、存在溴乙锭污染！染！v变性特性变性特性 cccDNA由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复pH条条件即可复性。件即可复性。提取纯化质粒提取纯化质粒DNA：微量碱变性法微量碱变性法裂解菌体细胞裂解菌体细胞加碱调加碱调pHpH至至121212.512.5DNADNA变性变性离心离心加加NaAcNaAc调调pHpH至至4.84.8去除蛋白质、去除蛋白质、RNARNA质粒质粒DNADNA纯度较低、周期较短！纯度较低、周期较短！v复制特性复制特性 拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所

5、含有的质粒拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所含有的质粒DNA分分子的数目子的数目 严紧型复制：严紧型复制：1-2个个 松弛型复制：松弛型复制：10-100个个 制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑制剂，增加质粒拷贝数！制剂，增加质粒拷贝数！三、质粒载体应具备的条件三、质粒载体应具备的条件v 具有复制起始位点具有复制起始位点v 具有至少两种易被检测的选择性标记具有至少两种易被检测的选择性标记v 具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS） 多克隆位点（多克隆位点（multi-cloning-site，MCS）：多种常用限制酶单一）：多种常用限

6、制酶单一识别序列所组成的识别序列所组成的DNA序列序列v 具有尽可能小的相对分子质量具有尽可能小的相对分子质量 易于分离纯化易于分离纯化 目的目的DNA装载能力强装载能力强 拷贝数高拷贝数高 多重酶识别位点几率低多重酶识别位点几率低v 应属于松弛型复制应属于松弛型复制v 应为非传递型应为非传递型四、几种常用的质粒载体四、几种常用的质粒载体 pBR322 pBR322来源：大肠杆菌来源：大肠杆菌OriOri：标记基因：标记基因：apapr r、tctcr r分子大小：分子大小：4363bp4363bp拷贝数：拷贝数：50-100/cell50-100/cellpBR3224363 bpOrigi

7、n of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII pUC18 pUC18来源：大肠杆菌来源：大肠杆菌OriOri：标记基因：标记基因：apapr r、lacZlacZMCSMCS：分子大小：分子大小：2686bp268

8、6bp拷贝数：拷贝数：1000-2000/cell1000-2000/cellv第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体噬菌体噬菌体DNADNA可以作为克隆载体的原因：可以作为克隆载体的原因：v 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞v 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增v DNADNA缺失达总量缺失达总量20%20%的的DNADNA时，仍不影响其特性，可为外源时，仍不影响其特性，可为外源基因提供装载空间基因提供装载空间一、基本概念一、基本概念噬菌体感染周期：噬菌体感染周期：E.coli吸附注入复

9、制包装裂解整合温和噬菌体温和噬菌体烈性噬菌体烈性噬菌体原噬菌体原噬菌体营养体营养体溶源菌溶源菌溶菌途径溶菌途径溶源途径溶源途径二、二、 噬菌体的形态结构及繁殖特性噬菌体的形态结构及繁殖特性v形态结构形态结构头部：正二十面体、头部：正二十面体、 直径约直径约55nmDNADNA：线性、约：线性、约48kb尾部：长约尾部：长约150nm150nm、粗、粗12nm12nmv繁殖特性繁殖特性噬菌体噬菌体E.coliE.coli溶源菌溶源菌裂解裂解侵染侵染浑浊噬菌斑浑浊噬菌斑三、三、 DNADNA的结构及功能的结构及功能5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头

10、部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因( (c c、c c) )早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l l - DNAANRJ左臂区：左臂区：AJJ中间区：中间区：J NJ N右臂区：右臂区：N RN Rc c基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活 c c基因表达：溶源途径基因表达：溶源途径 c c基因不表达：溶菌途径基因不表达：溶菌途径形成浑浊噬菌斑形成浑浊噬菌斑形成噬菌斑形成噬菌斑四、

11、四、 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建v 消除多余的限制性内切酶位点消除多余的限制性内切酶位点 点突变点突变 基因组置换、缺失基因组置换、缺失v 增加单一酶切位点增加单一酶切位点v 去除非必要区段去除非必要区段 噬菌体头部蛋白可包装噬菌体头部蛋白可包装DNADNA大小：大小：7575105% 105% DNADNA长度长度（383852kb52kb）v 增加筛选标记基因增加筛选标记基因五、五、 噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型v插入型载体：插入型载体： DNADNA缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源DNADNA插入的酶切位点插入的酶

12、切位点特点：承载能力较小（特点：承载能力较小（10kb10kb）筛选标记：基因插入失活筛选标记：基因插入失活免疫功能失活的插入型载体免疫功能失活的插入型载体- -半乳糖苷酶基因失活的插入型载体半乳糖苷酶基因失活的插入型载体表达阻遏蛋白表达阻遏蛋白免疫功能失活的插入型载体免疫功能失活的插入型载体C C基因基因体外包装体外包装插入片段插入片段C C基因基因不表达阻遏蛋白不表达阻遏蛋白 - -半乳糖苷酶失活的插入型载体半乳糖苷酶失活的插入型载体 表达酶表达酶LacZLacZ基因基因无色混浊噬菌斑无色混浊噬菌斑插入片段插入片段LacZLacZ基因基因 不表达酶不表达酶蓝色混浊噬菌斑蓝色混浊噬菌斑v替换

13、型载体：替换型载体： 又称取代型载体。在又称取代型载体。在DNADNA可替换片断两端具有两个限制可替换片断两端具有两个限制酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源DNADNA片断取片断取代代特点：承载能力大特点：承载能力大筛选标记：筛选标记：DNADNA大小大小- -半乳糖苷酶基因替换半乳糖苷酶基因替换六、六、 l-DNA作为载体的优点v DNADNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 v DNADNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量 v 重组重组DNADNA分子的筛选较为方便分子的筛选较为方便 LOGO