核酸的性质及研究方法课件.pptx

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1、 第一节第一节 核酸的性质核酸的性质一一 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收1 天然天然DNA2 变性变性DNA3 核苷酸总吸收值核苷酸总吸收值220 240 2602800.10.20.30.4波长（波长（nmnm）光光吸吸收收123DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱 鉴定纯度鉴定纯度 纯纯DNA的的A260/A280应为应为1.8（1.65-1.85） 纯纯RNA的的A260/A280应为应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。比值明显降低。 含量计算含量计算 1 A260（OD260）值相当于：）值相当于：50ug/mL双螺旋双螺旋

2、DNA 或：或：40ug/mL单链单链DNA（或（或RNA） 或：或：20ug/mL寡核苷酸寡核苷酸 判断判断DNA是否变性是否变性 在在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）核酸紫外吸收光谱的应用核酸紫外吸收光谱的应用二二 核酸的变性核酸的变性DNADNA的变性过程的变性过程部分双螺旋解开部分双螺旋解开 无规则线团无规则线团 链内碱基配对链内碱基配对核酸的变性是指核酸受到加热、极端的核酸的变性是指核酸受到加热、极端的pH或离子强度的降低等或离子强

3、度的降低等因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的氢键断裂，变成因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的氢键断裂，变成单链的过程，其中并不涉及共价键断裂。单链的过程，其中并不涉及共价键断裂。变性因素变性因素 ：热变性热变性 酸碱变性（酸碱变性（pHpH小于小于4 4或大于或大于1111） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后的理化性质： 260nm260nm吸收值升高。吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。二级结构改变，部分失活。 增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应：增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系

4、数增大减色效应减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。1 Tm1 Tm：熔解温度（熔解温度（melting temperaturemelting temperature）Poly d(A-T)DNAPoly d(G-C) DNA的变性发生的变性发生在一个很窄的温度在一个很窄的温度范围内，通常把热范围内，通常把热变性过程中变性过程中A260 达达到最大值一半时的到最大值一半时的温度称为该温度称为该DNA的的熔解温度，用熔解温度，用Tm表表示。示。 某些某些DNADNA的的TmTm值值60801001 .01 .41 .2100

5、%A260t 0CTmTmTmTmTmTm123123 熔解温度（熔解温度（Tm）浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在8295之间2 2 影响影响DNADNA的的TmTm值的因素值的因素 DNADNA均一性均一性 。均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性的均一性 。 G-C含量与含量与Tm值成正比。测定值成正比。测定Tm，可推知，可推知G-C含量。含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44 介质中离

6、子强度介质中离子强度离子强度高，Tm高。三三 核酸的复性核酸的复性在一定条件下，变性在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有复双螺旋结构，伴有A260减小（减小（减色效应减色效应）,DNA的的功能恢复。功能恢复。DNA的复性历程的复性历程 热变性热变性DNA在缓慢冷却时可以在缓慢冷却时可以 复性，快速冷却不能复性。复性，快速冷却不能复性。 DNA片段越大，复性越慢；片段越大，复性越慢； DNA浓度越大，复性越快。浓度越大，复性越快。 复性速度可用复性速度可用Cot衡量。衡量。Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前）的原始浓度，以摩

7、尔浓度（mol/L）表示，t为复性时间，以秒（s）表示。 复性分数 f = 1/1+kCot Cot 是指复性完成一半时的是指复性完成一半时的Cot值。值。根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数分子杂交分子杂交 不同来源的不同来源的DNA单链间或单链单链间或单链DNA与与RNA之间只要有之间只要有碱基配对碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（）制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实

8、例：通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例：southern印迹法印迹法 分子杂交的原理示意图分子杂交的原理示意图Southern印迹法印迹法限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜 四四 核酸的水解核酸的水解 酸水解酸水解 碱水解碱水解 酶水解酶水解 核酸的酶水解核酸的酶水解内切核酸酶对内切核酸酶对RNA的水解位点示意图的水解位点示意图5 ppppO

9、HPyPuPyPy1 pppGACUpppGA3 RNAase IRNAase IRNAase T1RNAase T1Pu ：嘌呤：嘌呤 Py：嘧啶：嘧啶 限制酶的命名：E.coRI第一位：第一位： 属名属名E（大写）（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：第四位： 菌株菌株R第五位：第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号从该细菌中分离出来的这一类酶的编号外切核酸酶对核酸的水解位点外切核酸酶对核酸的水解位点5 ppppOHBpppp3 BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶（ 5 5 端外切端外切5 5得得3 3）蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯

10、酶（ 3 3 端外切端外切3 3得得5 5）非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类可作用于可作用于RNA 或或 DNA第二节第二节 核酸研究的技术和方法核酸研究的技术和方法一一 DNADNA的化学合成：的化学合成：合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护 二二 核酸的分离、纯化和定量核酸的分离、纯化和定量 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。抑制核酸酶。 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于

11、水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀 DNADNA分离纯化分离纯化不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。核酸的离心分离纯化核酸的离心分离纯化 紫外分光光度法紫外分光光度法( (A260) ) 定磷法（定磷法（DNA含磷含磷9.2%，

12、RNA含磷含磷9.0% ） 定糖法（定糖法（DNA；二苯胺法，；二苯胺法， RNA；苔黑酚法）；苔黑酚法） 核酸的定量核酸的定量 核酸的纯度核酸的纯度 鉴定纯度鉴定纯度 纯纯DNA的的A260/A280应为应为1.8（1.65-1.85） 纯纯RNA的的A260/A280应为应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。比值明显降低。三三 DNADNA一级结构的测定一级结构的测定p末端终止法末端终止法p化学断裂法化学断裂法p焦磷酸测序焦磷酸测序 前两种方法一般都会用放射性32P对DNA进行标记，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对长度不同的

13、核酸片段进行分离，分离以后还需要使用放射自显影的技术进行观察和分析。目前已普遍使用荧光物质代替放射性同位素对DNA进行标记。焦磷酸测序是新一代DNA序列分析技术，该项技术无需电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。( (一一) ) 末端终止法末端终止法 又称双脱氧终止法英国 Sanger1955确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 DNA是一种双螺旋分子，其复制是在DNA聚合酶聚合酶催化催化下，以原来的两条母链上的核苷酸序列为模板模板，通过互补配对互补配对的方式合成新DNA链的过程

14、。复制需要引物和四种dNTPs，总是从5-端向端向3-端端进行。细胞内DNA复制的引物一般是RNA，但体外DNA复制的引物可以是人工合成的与模板链互补的一段寡聚脱氧核苷酸。复制开始于引物3-端自由的羟基，依据碱基互补碱基互补配对的原则，不断地形成新的3,5-磷酸二酯键，使DNA链得到延伸，直到一个新的DNA分子完全被合成。末端终止法末端终止法?进行四组平行反应?每一组反应混合物含有dATP,dGTP,dCTP和dTTP，有一种被32P标记?每一组反应含有一种少量的ddATP或ddGTP或ddCTP或ddTTP。?在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸。?有时，聚合酶使用ddN

15、TP，而导致末端终止。?每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双脱氧核苷酸结尾的DNA链。?对每一组反应混合物走凝胶电泳。?片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部。?从凝胶的底部向上读出序列。?将读出的序列转化成互补链的序列。（二） 化学断裂法 Maxam-Gilbert ， 1977原理：利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处： 32p ，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-

16、GCTACG化学断裂法化学断裂法p进行四组平行的反应：pG特异性剪切 在碱性条件下，先用硫酸二甲酯（ DMS ）处理，然后再使用哌啶处理。p嘌呤碱基特异性剪切DNA先进行酸处理，然后再加DMS。p嘧啶碱基特异性剪切先用肼处理，然后用哌啶处理。pC特异性剪切在高盐浓度下，先用肼处理，然后用哌啶处理。p即进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、AG、CT和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列。( (三三) ) 焦磷酸测序焦磷酸测序p焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将

17、其掺入到引物链的3-端并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。DNA自动分析仪的组成四四 RNA一级结构的测定一级结构的测定p目前用来测定RNA一级结构的方法主要有：（1）先使用逆转录酶将待测RNA逆转录成cDNA，然后再 使用Sanger的末端终止法进行测定；（2）用化学或/和酶学方法对放射性同位素标记的RNA进 行部分消化后，再进行聚丙烯酰胺电泳分析；（3）质谱法 一一 核酸与遗传信息的传递和表达核酸与遗传信息的传递和表达 （一）（一）

18、 DNADNA是基本遗传物质是基本遗传物质1944 1944 ， O. Avery O. Avery 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验1952 1952 ， A.D Hershey A.D Hershey 和和M. Chase M. Chase 噬菌体感染实验噬菌体感染实验第三节第三节 核酸的生物学功能和实践意义核酸的生物学功能和实践意义遗传密码遗传密码: DNA（或（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋）中的核苷酸序列与蛋 白质中氨基酸序列之间的对应关系称为白质中氨基酸序列之间的对应关系称为 遗传密码。遗传密码。密码子密码子(codon)：mRNA上每上每3个相邻的核苷酸编码个相邻的核苷酸编码

19、 蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个 核苷酸就称为一个密码子或三联体密码。核苷酸就称为一个密码子或三联体密码。遗传密码字典遗传密码字典UACGUCAGUCAG第二位第二位 第一位第一位（5） 第三位第三位（3）UCAGUCAGUCAG1965年编写出遗传密码表，密码子的阅读方向年编写出遗传密码表，密码子的阅读方向53（二）（二） RNA RNA 功能功能1 参与蛋白质的合成 2 RNA的转录后加工与修饰3 参与基因表达的调控4 生物催化作用（三）遗传信息传递的（三）遗传信息传递的 中心法则中心法则DNA:ATGCATGCATGCRNA:AUGCAUGCAUGC

20、PROTEIN:aa1aa2aa3aa4转录转录翻译翻译遗传信息传递的遗传信息传递的 中心法则中心法则蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存生物的遗传信息以密码的形式储存在在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制复制把亲代细胞所含的遗传信息忠把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录转录传递给传递给RNA，再由，再由

21、RNA通过通过翻译翻译转转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些中一些RNA病毒能以自己的病毒能以自己的RNA为模板为模板复制复制出新的病毒出新的病毒RNA，还有一些，还有一些RNA病病毒能以其毒能以其RNA为模板合成为模板合成DNA，称为，称为逆逆转录转录这是中心法则的补充。这是中心法则的补充。 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础

22、，不仅使人们对中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。（二）（二） 核酸与病毒核酸与病毒噬菌体噬菌体T2结构结构头部头部颈圈颈圈尾部尾部基板基板尾丝尾丝尖钉尖钉动物病毒切面模式图动物病毒切面模式图被膜（脂蛋白、被膜（脂蛋白、碳水化合物）碳水化合物）衣壳（蛋白质）衣壳（蛋白质）突起（糖蛋白）

23、突起（糖蛋白）病毒粒病毒粒（DNA或或RNA）核酸核酸乙肝病毒乙肝病毒艾滋病毒艾滋病毒三三 人类基因组计划简介人类基因组计划简介 （Human Genome Project，HGP） 该计划是美国科学家在该计划是美国科学家在1985年率先提出，年率先提出，1990年正年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，1999年我国成为年我国成为 HGP的第六个成员国。的第六个成员国。 HGP旨在阐明人类基因组旨在阐明人类基因组DNA所具有的所具有的310109 9核苷酸核苷酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。水平上全面地认识自我。 到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已完成。工作已完成。 HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。