PCR实验室.docx

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1、PCR实验室 简介 Pcr试验室又叫基因扩增试验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特别DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能快速驾驭患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异样变更能刚好推断病人最适合运用哪类抗病毒药物、推断药物疗效如何、给临床治疗供应了牢靠的检验依据 条件 1、必需拥有标准的的PCR荧光试验室; 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosys

2、tems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它 有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广 泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍 2、检测设备必需符合标准PCR荧光试验室设置要求; 荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。 3、必需通过国家临床检验中心的验收和认证; 4、检测人员必需通过国家临检中心业务培训并取得合格证书; PCR试验室内工作人员必需参与由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR试验室通过验收，试

3、验室至少必需应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR试验室必需建立严格的试验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保试验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果精确、确保试验室卫生平安，确保试验室长期稳定运行 5、必需在无菌无尘环境下进行操作 功能 能够对患者病情进行科学、精确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以治疗，人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能快速消退临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细

4、胞内的病毒，为防止再感染供应了长期爱护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。 建立方法 1、建立样品打算区 这个区域特地用作样品的打算，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应当实行预防措施：PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。组织培育物、组织标本和血清样品都带进样品打算间处理，以依据应用的须要提取DNA或RNA。用于样品处理的工具不能被用作一般分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。DNA样品应当用有特地的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。大体积样品应当用单独包装的无菌一次性移液管吸取。管子打开前都要简短离心以削减气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这

5、样会产生气溶胶。任何时候都应当穿试验服和带手套，手套要常常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。试验服要特地用于样品打算间，常常清洗。 2、样品打算和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤须要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避开这一问题，反转录一步可以在样品打算区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。 3、建立前PCR区。 该去特地用于打算各种反应，这个区域必需保持干净，而且没有来自克隆和样品打算的污染。前PCR区必需要有试剂和打算，特殊是特地用于前PCR区的正压活塞式移液管。 4、PCR试验室试剂的操作。 所用的全部溶液都应当没有核酸和（或）核酸

6、酶（DNase和RNase）污染。全部PCR试剂中运用的水都应当是高质量的簇新蒸馏的去离子水，用0.22m过滤的，并且是高压灭菌。在20到25贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。所用试剂都应当以大体积配制，试验一下看试剂是否满足，然后分装成仅够一次运用的量进行贮存。全部试剂和样品打算过程中都要运用一次性灭菌的瓶子和管子。新配制的试剂在用于打算新的标本之前应当加以检验。样品打算和前PCR区所运用的移液管在不运用时都应当当心保存。 5、在前PCR区建立PCR混合物。 可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20或

7、4，在试验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。假如你的试验室运用多套引物，以致于配制包括全部试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。作为一个规则，应当保存一套阴性、弱阳性和强阳性比照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和干净程度。而且，你也希望通过运用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性比照应当包括核酸以外的全部试剂。当做阳性比照时，有两个理由确定了应当运用最少数量的核酸。由于必需有比照反应，比照模板的特点应当予以考虑。 6、

8、限制污染的方法。 已设计出很有力的酶学方法用来消退一种形式的污染运用UNG，这一技术能有效地消退由PCR产物引起的污染。另一种限制污染的方法是运用紫外线，这种方法不能完全消退污染问题，但可以将污染降低几个数量级。 7、后PCR区PCR完成以后，须要分析样品并说明数据，应当留出一个特地用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中运用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必需是特地用于这一目的，决不能把试验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动 PCR试验室 PCR试验室 PCR试验室说明 PCR试验室检查要点() PCR试验室认证体会 PCR试验室审核表 PCR试验室装饰要求 PCR室试验室污染分析流程 PCR试验室基本要求 PCR试验室可开展项目 本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第6页 共6页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页