酵母表达系统概述及相关研究进展.docx

《酵母表达系统概述及相关研究进展.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母表达系统概述及相关研究进展.docx（17页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、酵母表达系统概述及相关研究进展 酵母表达系统的探讨进展和前景 ( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院 ) 摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而胜利的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分别纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对将来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。 关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物 引言 酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简洁

2、, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基养分型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae） 在分子遗传学方面被人们的相识最早， 也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基养分型酵母（methylotrophic yeast）为代表的其次代酵母表达系统。其中毕赤酵母（P.pastoris）是继S.cerevisiae 之后被快速推广的一种外源基因表达的宿主菌。

3、 酿酒酵母难于高密度培育，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。 与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点 1：（1）生长速率快，易于高密度培育（2）在几乎不含蛋白质的培育基中具有高水平产率 （3）消退了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有

4、病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培育基中提纯而不必收集酵母本身细胞。 基因工程与酵母表达系统 即使酵母表达系统具有一些优势，但在用于生产蛋白质等药物时，还须要选择合适的载体并对宿主菌的某些代谢途径进行改造，使之利于目标产物的表达，要用于工业生产，还需依据实际状况优化培育条件，比如pH，温度，溶氧量，培育基养分，特别添加剂等。 酿酒酵母的表达载体有自主复制型和整合型，自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，AR

5、S)，能够独立于酵母染色体外进行复制 ，假如没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得留意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，致

6、使产物的抗原性明显增加。 毕赤酵母的表达载体多采纳整合型载体，即将异源基因通过载体整合进酵母基因组中，这是由于没有适合毕赤酵母的游离型表达载体。全部巴斯德氏毕赤酵母的表达载体都是一个表达组件，它由一个启动子序列（大多是AOX1启动子），一个来自AOX1的转录终止序列用以指导3终止过程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它们之间有一个或多个克隆位点用以插入外源基因。这样的设计保证了产物(cap-AOX1 5UTR-ORF-3UTR-polyA)是一个成熟的mRNA以适应毕赤酵母的细胞体系，确保了信息的稳定性和有效性。检测表达所用的标记基因一般是HIS4（组氨醇脱氢酶基因），有时也用kan （卡那霉素抗性

7、基因）或Sh ble.此外，有时为了防止酵母自身蛋白酶对所要表达的异源蛋白的降解，会运用蛋白酶缺陷突变型或降低发酵温度，保证目的蛋白的产量和得率。发酵过程一般分两个阶段，第一阶段是细胞以甘油为碳源生长，甘油耗尽后进入其次阶段，加入甲醇诱导AOX1启动子的转录翻译，从而使异源基因表达，生产目标蛋白。 酵母表达系统探讨进展 1 利用酿酒酵母生产青蒿素前体青蒿酸 青蒿素（Artemisinin）是目前治疗疟疾的高效药物，这主要是由于疟原虫（Plasmodium falciparum）渐渐对其它药物产生了抗药性。现在青蒿素的产量远达不到需求量，所以Jay D.Keasling 等人通过酿酒酵母生产它的

8、前体artemisinic acid，成本低，环保，可作为高质2R 量和牢靠的青蒿素来源。这个试验通过改造甲羟戊酸途径，引入两个来自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase (ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使酿酒酵母获得将amorpha-4,11-diene氧化为artemisinic acid的三步途径。同时，还导入了CYP71AV1的自然氧化还原配体CPR (cytochrome P450 oxidoreductase)，在这之前，还需将法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyro

9、phosphate）的合成途径修饰，削减它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的酿酒酵母EPY224生产artemisinic acid，不仅纯度较高，易于提取分别，而且不受气候影响。 2利用毕赤巴斯德氏酵母生产人源抗菌肽LL-37 抗菌肽是生物体抵挡外源性病原体的防卫反应中所产生的一类小分子多肽。很多传统的抗生素具有毒副作用且能够诱导耐药菌株的产生，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广和作用机制独特等特点，还有探讨表明，hCAP （Human cathelicidin antimic

10、robial peptide）是人皮肤在受伤或炎症刺激下，嗜碱性粒细胞分泌的一种防卫或抗微生物的肽，在人类中只有LL-37一种。固相化学合成技术可以生产像肽这样较短的氨基酸序列，不过成本太高。Yong-Seok Kim等人3利用pGAPZ-E（pGAPZB载体的游离形式）将编码成熟LL-37的111bp的基因片段采纳电穿孔方法转化到P.pastoris X-33中，进行细胞内表达，表达的重组LL-37通过LC-ESI-MS/MS检测确定，发觉有5kDa的LL-37条带。酵母的表达出来的LL-37的粗提取物对Micrococcus luteus具有抑制活性。表达载体采纳GAP强启动子，另外还进行

11、了有a-MF外分泌信号的载体pGAPZaA，结果采纳这个载体的X-33培育物中没有发觉胞外分泌的LL-37.另外还利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H进行了转化，LL-37在其中的表达水平与在X-33中的没有显著差异。这个试验说明白利用游离型表达载体在P.pastoris X-33中可以胜利表达LL-37，并且具有生物活性，可以用于生产这类抗菌肽药物。 3人源化的毕赤酵母生产糖蛋白类药物 人体内，除了抗体外的大多数糖蛋白的半衰期和治疗潜力依靠于末端的唾液酸化，这是由于一个糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等会被体内的糖特异性受体或凝集素识别并被清除，也就失去疗效了。酵母和丝状

12、真菌在表达这类糖蛋白方面具有肯定前景。用酵母表达在人体内具有活性的糖蛋白须要进行许多基因删除或修饰，Tillman U.Gerngro等人4利用毕赤酵母构建出能表达重组红细胞生成素（EPO）的菌株P.pastoris YSH597。这个菌株是在以前的菌株RDP762基础上利用pSH926载体引入了5个新的外源基因构建成的，为的是使这个酵母能完成人源的末端唾液酸化。对自然酵母的改造设计到四个酵 母特异性糖酰化基因的敲除和14个异源基因的导入。利用SDS-PAGE和HPLC提纯分别的重组EPO具有与剂量相关的生物学活性。EPO是一种高度糖基化的蛋白质，利用酵母表达须要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修饰

13、后再加上人源的唾液酸化过程，才能产生有活性的EPO（已经进行动物试验）。这项探讨表明利用酵母生产EPO等同类糖蛋白具有可行性，不仅能节约时间，而且节约成本，大量生产以缓解对这类医疗药物的需求。 酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或困难型糖蛋白，而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。杨晓鹏等人5在前期胜利敲除毕赤酵母-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化，获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01 (ura 3、och1) 的基础上，构建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI载体，通过表达不同物种来源的-1,2-甘露糖苷酶I (MDSI) 的活

14、性区与酵母自身定位信号的融合蛋白，并通过DSA-FACE (基于DNA 测序仪的荧光协助糖电泳) 分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF (人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白) 的糖基结构，发觉当编码酿酒酵母-1,2-甘露糖苷酶 (MnsI) 基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时，毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2 哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或困难型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。 4在巴斯德氏毕赤酵母中高水平表达一种合成酶植酸酶 植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物种子中磷元素的

15、主要储存形式, 普遍存在于植物性食品和饲料。人和单胃动物畜禽和鱼类等缺乏内源性植酸酶不能利用有机植酸磷。饲料中常添加无机磷酸盐以满意单胃动物的磷养分需求，随之产生了诸多问题，最主要的是植酸作为一种抗养分因子，在体内络合多种矿质元素和蛋白质等，常引起人和单胃动物各种养分不良症，而且未被利用的植酸磷被微生物降说明放无机磷易引发水体磷污染。植酸酶（Phytase）是一类特别的正磷酸单酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，在动物养分、资源环境爱护和人类健康等领域愈来愈显示出巨大的应用潜力和探讨价值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较简单等诸

16、多优点，对其探讨和开发最为广泛和深化。Ai-Sheng Xiong等人利用一种担子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶6（一种6-植酸酶）基因，优化出适合P.pastoris的密码子的基因序列phy-pl-sh，连接上信号肽MF4I的基因，采纳含有AOX1启动子的pPIC9K载体，转化并使毕赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，产量为12.2g/L.限制的培育条件是：30C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培育。酶蛋白检测和酶活测试发觉，酶的糖基化较严峻，用水解酶Endo Hf在37C下处理提纯的酶蛋白4h，得到的片段较均一，且在pH4.5下具有最大 酶活力。对基因稳定性和酶

17、的热稳定性检测发觉效果良好，此外他们还利用DNA Shuffling获得了几种热稳定的酶的候选基因，这项探讨表明利用毕赤巴斯德氏酵母生产6-植酸酶具有很大潜力，可以用于工业生产。 5毕赤酵母表达大分子类药物 在毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，显著地提高了SOD 爱护HeLa 细胞免受氧化损伤的实力。细胞质转导肽 (CTP，一种能够携带外源大分子穿过细胞膜，定位于细胞质的短肽)运输人铜锌超氧化物歧化酶 (Cu/Zn SOD) 跨过细胞膜进入细胞质，可以提高其生物利用度。李沛志等7利用P.pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表达质粒pPIC9K转化表

18、达了融合蛋白CTD-SOD。首先，设计含有CTD转导肽基因序列的融合基因，连接至pPIC9K 质粒并用它转化E.coli Top10并进行菌落PCR筛选，抽提出重组质粒并电击转化巴斯德毕赤酵母，将转化胜利的酵母接种到YPD 培育基中，通过加入甲醇至终浓度0.5诱导表达。培育结束后分析发酵液中诱导蛋白的表达量，纯化后并进行对细胞的爱护作用测试。本探讨胜利地在毕赤酵母表达系统中高效表达了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，发酵上清中重组蛋白的含量为156.5 mg/L 。纯化得到的CTP-SOD 分子量约为22.5 kDa。CTP-SOD 预处理Hela 细胞可显著地提高了邻苯三酚 (Prog

19、allol) 诱导氧化胁迫下HeLa 细胞的存活率，较野生型SOD 相比具有较强的爱护作用。但是，CTP 和其他种类的PTD（蛋白转导域，Protein transduction domain） 相比是否更有利于SOD或其他在细胞质中起作用的药物发挥功能都有待进一步深化的探讨来证明，具有跨膜转导实力的新一代药物运输载体PTD 将会促进多肽、核酸等大分子药物的快速发展，为生物大分子药物的应用带来更广袤的前景。 在哺乳动物中, 三叶型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通过增加细胞迁移，促进细胞增殖，对抗细胞凋亡等过程参加黏膜的修复并维持其完整性。Bm-TFF2, 一种

20、从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分别得到的两栖类三叶因子, 具有比人三叶因子更强的生物学活性。余果宇等人 8以Bm-TFF2 的cDNA 为模板, 利用PCR 方法扩增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 启动子和-因子信号肽序列的表达载体pPIC9K 中, 采纳毕赤酵母表达系统进行分泌表达, 并用G418 筛选高拷贝整合转化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都检测到Bm-TFF2 被分泌性表达于酵母上清。在1%的甲醇诱导表达不同时间后, 重组蛋白在72 h 的表达量最大, 可达50 mg/ L; 而不同浓度的饱和硫酸铵沉淀菌液上清时, 80%的饱和硫酸铵沉淀量最大。这些

21、结果表明, 重组质粒Bm-TFF2-pPIC9K 胜利构建并在真核细胞中高效表达, 这为进一步探讨Bm-TFF2 的生物学活性及其结构与功能关系奠定了基础。 6毕赤酵母在表达病毒蛋白用于疫苗和诊断方面的应用 人轮状病毒的VP7 基因目前已有用大肠埃希氏菌、乳酸杆菌，植物和哺乳动物细胞等表达系统的报道，而酵母表达尚未见报道。利用巴斯德毕赤酵母表达轮状病毒的爱护性抗原VP7， 以制备轮状病毒基因工程疫苗，可为预防轮状病毒感染供应一条有效途径。卢颖等人 9将已构建的重组质粒VP7 -pPICZA 经Sac线性化后，通过电转化法转入毕赤酵母GS115中，然后Zeocin 平板筛选并进行PCR鉴定及Mu

22、t 表型筛选，胜利构建VP7 基因的重组酵母表达系统，为进一步表达VP7 基因供应理论依据和试验基础。 为了分析真核体系中表达的乙型脑炎病毒E蛋白的生物学特性，张健等人10以乙脑病毒SA-14 株为代表， 构建了E 蛋白基因的毕赤酵母表达系统。首先，应用RT-PCR 法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因，定向克隆入载体pPICZA，然后将重组质粒以Pme线性化并电转化入毕赤酵母GS115 感受态细胞，最终用Zeocin筛选转化子进行鉴定。PCR 扩增产物约为1 350 bp，定向克隆获得pPICZA-E 表达载体，经测序结果与Genbank 相应序列比较，核苷酸序列同源性为100%，电转化得到巴氏

23、毕赤酵母重组菌株GS115-E，提取其基因组DNA 经PCR鉴定与预期相符。本探讨构建的乙型脑炎病毒E 基因毕赤酵母表达系统为进一步进行E蛋白真核表达探讨奠定了基础。 酵母表达系统表达病毒蛋白抗原还在血清学诊断方面有所进展。于天飞等人11在多酵母表达系统（GS115/pPIC9-TY，GS115/pPIC9K-ts（Mut+），KM71/pPIC9-ts）中表达了含有猪传染性胃肠炎病毒S 基因B 和C 抗原位点片段。经检测表明，不同类型酵母表达系统蛋白表达量和抗原性差异不大，探讨中获得的重组蛋白为建立TGE血清学检测方法供应了必要的物质基础本试验所获得蛋白为PRCV S蛋白缺失部分，以此重组蛋

24、白作为诊断抗原建立的血清学诊断方法可望避开潜在的PRCV感染对检测TGE的干扰，得出筛选生长速度较快的GS115/pPIC9-TY适合作为今后进一步应用的候选重组菌 总结 由于酵母表达外源蛋白，特殊是药用蛋白质的种种优势，促使探讨人员不断改进酵母的遗传特性和生理特性。这些突破更加提高了酵母在生产药用蛋白中的应用。在工作中对不同来源、不同作用特点外源蛋白的探讨和开发应用，毕赤酵母表达体系是一个很好的选择，我们须要综合考虑这一表达体系的上述特点，对目的外源蛋白基因进行相应的改造，设计合理的构建策略，使重组外源蛋白按我们的要求进行表达，有助于获得大量有活性的表达产物。信任这一表达体系的采纳和不断深化

25、探讨势必为基因工程药物的发展供应加速度。 参考文献 1V.Renugopalakrishnan, et al.Expreion of recombinant proteins in Pichia pastoris.Appl Biochem Biotechnol 2007;142:105-124. 2Dae-Kyun Ro, et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature 2006;440:940-943. 3In Pyo Hong, Sung Jae

26、Lee, Yong Seok Kim, Shin Geon Choi.Recombinant expreion of human cathelicidin(h CAP18/LL-37) in Pichia pastoris.Biotechnol Lett 2007;29:73-78. 4Tillman U.Gerngro, et al.Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins.Science 2006;313:1441-1443. 5Xiaopeng Yang, et al.Cons

27、truction of yeast Pichia pastoris to produce Man5GlcNAc2 mammalian mannose-type glycoprotein.Chin J Biotech 2022;27:108-117. 6Aisheng Xiong, Quanhong Yao, et al.High level expreion of a synthetic gene encoding Peniophora lycii phytase in methylotrophic yeast Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol

28、 2006;72:1039-1047. 7李沛志，任军乐，安婷，刘堰.融合蛋白CTP-SOD 在毕赤酵母中的表达、纯化及抗氧 化实力.生物工程学报 2022;26:324-329. 8余果宇，张红芸，张勇，江萍，李文辉，张云.Bm-TFF2 在毕赤酵母中的表达及鉴定.动物学探讨 2022;31:565-569. 9卢颖，佟伟，单颖，张轶博，吴囡，董颖，李华，吴学敏.人轮状病毒外衣壳糖蛋白VP7 基因毕赤酵母重组表达系统的构建.现代预防医学 2022;37:3523-3528. 10张健，李一卿.乙型脑炎病毒E 蛋白毕赤酵母表达系统的构建.天津医科高校学报 2009;15:40-43. 11于天

29、飞，黎明，吕建伟等人.TGEV 截短S 基因片段在多酵母表达系统中的表达.高师理科学刊 2022;31:73-75. 酵母表达系统概述及相关探讨进展 酵母双杂交技术探讨进展 煤矸石利用的探讨进展概述 探讨进展 回顾心律失常相关探讨进展 酵母表达系统运用心得 毕赤酵母表达系统简介 聚氨酯探讨进展 酵母菌分类学的探讨进展王志伟 果农间作探讨进展 本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第17页 共17页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页第 17 页 共 17 页