生物化学实验(共4页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上实验一 1、糖类的颜色反应1. -萘酚反应糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色物质。注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，不是糖类的特异反应。2. 间苯二酚反应 在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。 2、还原作用许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还

2、原性及还原糖的定量测定。本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是Cu2的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）的Cu2O沉淀。实验二 脂肪碘值的测定碘值（价）是指100g脂肪在一定条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用以判断脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。常用碘与脂肪中不饱和脂肪酸的双键起加成作用。脂肪的不饱和程度越高，所含的不饱和脂肪酸越多，与其双键起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不饱和度。 I2+CH=CHCHICHI本实验用

3、溴化碘(Hanus试剂)代替碘。用一定量(必须过量)溴化碘和待测的脂肪作用后，用硫代硫酸钠滴定的方法测定溴化碘的剩余量，然后计算出待测脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。加成作用：IBr+CH=CHCHICHBr 剩余溴化碘中碘的释放：IBr + KI KBr + I2再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘： I2 +2Na2S2O3 2Na2S4O6+2NaI思考题：何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？ 在各种分析方法中，为消除干扰，用与测定试样时完全一致的条件进行测定的溶液。 意义：去除一些杂质的影响，使实验结果更有说服力实验三 氨基酸的分离鉴定-纸层析法 纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的

4、纤维之间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易扩散，并能与跟水混合的溶剂(有机相)形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： 原点到层析点中心的距离 Rf _ 原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性

5、质、溶剂系统、层析滤纸的质量、展层方式、层析温度和pH等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。思考题1何谓纸层析法？2何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？3怎样制备扩展剂？ 将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合充分振荡静置后分层，放出下层水层，上层即为扩展剂实 验 四 蛋白质及氨基酸的呈色反应 （一）双缩脲反应双缩脲反应:尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。注意:双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所特有，许

6、多含有一个肽键和一个氨基的物质也能发生此反应 如 CS-NH2，-CH2-NH2，O=C C=O 等。 NH2 NH2NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子( Cu(NH3)42+ ，四氨合铜)。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 （二）茚三酮反应除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应 (尿素、马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。)因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定是蛋白质或氨基酸。

7、在定性定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1：浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。(此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。) （三）黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。(多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注意苯丙氨酸不易

8、硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反应非常灵敏。) （四）考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。(它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2分钟达到平衡，在室温1小时内稳定，常用来定量测定蛋白质含量)通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什么？实验五 蛋白质的等电点测定和沉淀反应（一）蛋白质的等电点(pI) ：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度的影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动

9、 ，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点(pI)。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低(或沉淀量最多)时的溶液pH值。本实验借观察不同pH缓冲液中溶解度以测定酪蛋白的等电点(二)蛋白质的沉淀及变性 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可以分为两类：(1)可逆的沉淀反应(不变性，如盐析作用或低温作用下用乙醇或丙酮短时间作用)(2)不可逆的沉淀反应(变性，如加热沉淀与凝固、与重金属

10、离子或某些有机酸反应等) （变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性)思考题：何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？实验六 酶的特性（一）温度对酶活力的影响：酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。(大多数动物酶的最适温度37-40，植物酶的最适温度为50-60。)高温可以使酶失活，低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100，其活性并无明显改变，但在100的溶液中却很快地完全失去活性。淀粉被唾液淀粉酶水解的产物有糊精和麦芽糖。淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐

11、色或红色、不呈色。麦芽糖遇碘也不呈色。因此，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。（二）pH对酶活性的影响：酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。(三)唾液淀粉酶的活化和抑制：酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为唾液淀粉酶的抑制剂。(四)酶的专一性：酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。(淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉最终生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗

12、糖水解生成还原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用本尼迪克特试剂检查糖的还原性。)思考题：1、什么是酶的最适温度和最适 pH？答：相同条件下，酶活性最高时对应的PH值2、什么是酶的活化剂？、什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区别？答：能加快酶促反应速率的物质为活化剂；抑制酶促反应速率的物质为抑制剂；使酶变性失活的物质为变性剂；活化剂与抑制剂只影响酶促反应速率，不影响酶的活性，但变性剂会使酶彻底失活实验七 米氏常数的测定米氏方程Km值是酶的一个特征常数，测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。双倒数作图法是实验方法测定Km值的最常用的比较方便的方法。实验时选择不同的S，测定相对应的V，求出两者的

13、倒数，以1/V对1/S作图，则得到一斜率为Km/Vmax的直线。将直线外推与横轴相交，由1/Km=-1/S求出Km。本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法(原理参见P148)判断自由氨基增加的数量来追踪反应。思考题：1、 如何正确测定酶促反应速度？ 答：1.底物 必须要保证要足够的底物，使酶能完全发挥其催化功能。 2.时间的控制 根据酶促反应曲线可以看出，最开始曲线斜率比较大，然后趋于平缓（这种原因可能是

14、生成的产物促进逆反应或是酶失活），由此，如果测定的时间选择不当的话，测的速度也不是初速度，所以在测定的时间必须掌握在曲线斜率比较大的那段时间内。当然，除这些之外，需给酶提供最适温度、最适PH，保证没有抑制剂存在。2、由实验所得曲线可以看出底物浓度对酶反应的影响有何特殊规律？答：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后，随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加实验八 维生素C的定量测定 还原

15、型维生素C(抗坏血酸)能还原染料2,6-二氯酚靛酚钠盐，本身则被氧化成脱氢维生素C。2,6-二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，被还原后则脱成无色。本实验用2,6-二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。滴定开始时，样品液中的维生素C立即将滴入的2,6-二氯酚靛酚还原脱色，当样品液中维生素C全部被氧化时，再滴入的2,6-二氯酚靛酚就不再被还原脱色而呈浅玫瑰色，达到滴定终点。此时，记录滴定所消耗的2,6-二氯酚靛酚标准液量，按公式即可计算出样品液中还原型维生素C的含量。思考题： 本实验中用2,6-二氯酚靛酚滴定Vc方法的优缺点？答：该法简便易行、快速，目前仍被广泛运用。但此方法尚存着一定均缺点，突出的一点是滴定终点难以确定。利用2.6一二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性物质溶液而当抗坏血酸尚未被全部被氧化时，滴下的2.6一二氮酚靛酚立即被还原成无色。而溶液中的坑坏血酸一旦被氧化，则滴入的2.6一二氮酚靛酚则立即使溶液呈现红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚被全部氧化，此时为滴定终点。此种方法对于无色或淡黄色、绿色样品液的滴定终点易确定，而对于山植、大枣、草葺、酸枣等紫色、粉红或褐色等色泽的朵蔬样品液的滴定终点就难以观察确定。专心-专注-专业