植物基因转化及转基因植物的分析及鉴定.doc

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1、 - .植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定实验目的1 了解创立烟草突变体库的方法；2 理解每种方法的根本原理；3 掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的根本过程。实验原理随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此根底上开展功能基因组的研究是目前的核心研究容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要容，在此根底上也能进展正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地别离鉴定靶基

2、因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创立是烟草功能基因组学研究中的重要容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的根底，也是别离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-D

3、NA的共别离关系，存在共别离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进展下一步的分析图实验4-1。T-DNA 载体构建转化植物T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1别离确定T-DNA与突变型共别离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNATail PCR)利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证遗传互补测验，别离的野生基因转化突变体，回复功能图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的根本流程TAIL-PCR别离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物根据

4、T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62和一个短的随机简并引物AD，Tm值44-46组合，以突变体基因组DNA为模板，进展屡次PCR反响，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进展的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段实验图4-2，可作为探针，筛选别离基因。 TAIL-PCR别离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。 实验图4-2 TAIL-PCR反响流程图 本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA13

5、01的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草， 以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的序列比照，获得功能基因的全序列。仪器、材料和试剂一仪器高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。二材料烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株

6、，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。三试剂1. 2CTAB提取液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0 2w/vCTAB 1.4mol/L NaCl 40mmol/L b-巯基乙醇 20mmol/L EDTA2. TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA3. 50TAE电极缓冲液 1000mlTris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml4. 10次氯酸钠5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)6. 70乙醇7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L

7、 Tris.HClpH8.0，10 mmol/L EDTApH8.0100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5冰乙酸，28.5ml无菌水100ml9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2SDS溶液各30ml，用时1:1混合10. LB液体培养基 配制每升培养基，应在950mL去离子水中参加： 胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g 酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，参加200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，参加去离子水至总体积为1升，121高压灭菌20

8、分钟。11. MS根本培养基 大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/L NH4NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0 KNO3 1900 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 CaCl22H2O 440 MnSO44H2O 22.3 盐酸吡哆醇Vb6 0.5 MgSO47H2O 370 ZnSO47H2O 8.6 盐酸硫胺素Vb1 0.l KH2PO4 170 NaMoO42H2O 0.25 肌醇 100 CoCl26H2O 0.025 CuSO45H2O 0.025 FeSO47H2O 27.8 配制方法母液：大量元素50 400mL硝酸铵 33g；硝酸钾 38g；磷

9、酸二氢钾 3.4g；七水合硫酸镁 7.4g；铁元素100 200mL七水合硫酸亚铁 0.556g；七水合EDTA二钠 0.746g；有机营养100 200mLGly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇 2g；烟酸 0.010g；微量元素1000 200mL碘化钾 166mg；硼酸 1240mg；一水合硫酸锰 3380mg；七水合硫酸锌 1720mg；二水合钼酸钠 44mg；五水合硫酸铜 5mg；六水合氯化钴 5mg；氯化钙50 400mL 氯化钙8.8g12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS根本培养基 0.2mg/L 6-BA0.02mg/L NAA 3%蔗糖 0.

10、6%琼脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL； NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL； 2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均为0.5mg/mL13. 筛选培养基：MS根本培养基0.2mg/L 6-BA 0.02mg/L NAA3%蔗糖0.6%琼脂100mg/L羧苄青霉素14. 抗生素母液的配制KANA50mg/mL 1g KANA溶于20mL蒸馏水；RIF50mg/mL 0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR30mg/mL 0.6g STA溶于20mL蒸馏水；羧苄青霉素100mg/mL 2

11、g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。潮霉素B50mg/mL 可以直接购置实验步骤I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生1. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70酒精中30秒，然后移入10的次氯酸钠溶液中510分钟消除外植体外表的微生物。无菌水至少洗涤3次消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净，每次停留35min。将无菌叶片剪成0.5cm0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定

12、期观察并更换培养基。II 转基因烟草的培养1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中Kana 50ug/ml、RIF、STR， 27，180rmin振摇培养过夜。将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的一样条件培养6小时左右，使菌液到达OD6000.20.5，用来侵染烟草叶片 。2. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70酒精中30秒，然后移入10的次氯酸钠溶液中510分钟消除外植体外表的微生物。无菌水至少洗涤3次消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净，每次停留35min。将无菌叶片剪成0.5

13、cm0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染510分钟。将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗12次。4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26黑暗条件下共培养3天。5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长。每隔34天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26，日照16h。4周后转基因细胞分裂生长形成

14、大量愈伤组织并有根、芽分化。接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验无愈伤组织生长和器官分化。 转基因烟草的检测1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，参加0.5mL65预热CATB抽提液65水浴抽提30min，间歇混匀；2. 取上清各参加0.5mL氯仿异戊醇体积比24:1去除蛋白，12000rpm离心10min；3. 取上清参加1体积预冷异丙醇至-20出沉淀3060min，8000rpm离心15min；4. 弃上清，70%乙醇洗涤2次枯燥，避光保存；5. 参加15L蒸馏水溶解并电泳检测0.7%琼脂糖凝胶电泳；6. 提取pMD

15、C83rc质粒：13-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清；2加300L预冷溶液I，颠倒混匀6-8次；3加300l新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次；4加300l预冷溶液III，颠倒混匀6-8次；512000 rpm 15min，转移上清液；6参加0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min；7弃上清，70%乙醇洗沉淀；8空气枯燥，20ml 蒸馏水溶解，-20贮存。7. 对提出的基因组DNA进展PCR扩增；引物和扩增体系同上述的PCR步骤；GFP引物GFP-F: 5- GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3， GFP-R: 5-TTAGTGGT

16、GGTGGTGGTGGTGTTTG-31在0.2mlPCR管中，按照下表配制PCR反响体系25L。无菌水10PCR BufferdNTP MixtureGFP-FGFP-REx-Taq 模板DNA14.2 ul2.5L1L0.5L0.5L0.3L1 ul2按如下程序对转基因烟草、未转基因烟草和阳性质粒进展PCR扩增。温度9494587272时间sec30106060600循环30次8. 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物9. 配制1%琼脂糖凝胶， PCR产物10L上样，同时用2L DNA Marker作为DNA相对分子质量标准。恒压120V电泳20min。在凝胶成像系统下观察结果T-DNA载体质粒含有绿色荧光蛋白GFP基因，扩增产物为GFP基因的片段，长735bp。10. 剪取一样株烟草小叶片放在紫外灯和荧光显微镜下观察，是否产生绿色荧光。- -.可修编-