病毒的遗传分析课件.pptx

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1、第八章第八章 病毒的遗传分析病毒的遗传分析 本章重点本章重点:以噬菌体为材料以噬菌体为材料1、分析基因的精细结构、分析基因的精细结构2、基因定位与遗传作图、基因定位与遗传作图 病毒（病毒（virus）既不属于原核生物，也不属于真核生物，）既不属于原核生物，也不属于真核生物，属非细胞型生命形态，又称为分子生物。属非细胞型生命形态，又称为分子生物。其一般特点是其一般特点是： 个体极小：介于个体极小：介于20300 nm之间之间，能够通过细菌滤器；，能够通过细菌滤器； 无细胞结构无细胞结构：仅含一种类型的核酸（或：仅含一种类型的核酸（或DNA或或RNA），），其主要成分是蛋白质和核酸；其主要成分是蛋

2、白质和核酸； 没有完整的酶系和蛋白质合成系统，离体条件下，以无生没有完整的酶系和蛋白质合成系统，离体条件下，以无生命的化学大分子状态存在，可形成结晶，命的化学大分子状态存在，可形成结晶，不能进行独立的代不能进行独立的代谢活动；谢活动； 严格的活细胞内寄生严格的活细胞内寄生，以复制的方式增殖；，以复制的方式增殖； 对抗生素不敏感对抗生素不敏感，但对干扰素敏感，但对干扰素敏感通常按宿主类型病毒分为：通常按宿主类型病毒分为：1. 噬菌体（噬菌体（bacteriophage 或或phage）: 细菌病毒、真菌病毒及藻类病毒细菌病毒、真菌病毒及藻类病毒2. 植物病毒植物病毒(plant virus):

3、感染高等植物、藻类等真核生物的病毒感染高等植物、藻类等真核生物的病毒3. 动物病毒：昆虫病毒和脊椎动物病毒动物病毒：昆虫病毒和脊椎动物病毒8.1 病毒的形态结构与基因组病毒的形态结构与基因组8.1.1 病毒的形态结构病毒的形态结构 病毒的形态结构只能借助电子显微镜才可以观察到。病毒的形态结构只能借助电子显微镜才可以观察到。成熟的具有侵染力的病毒个体称为病毒粒子（毒粒），成熟的具有侵染力的病毒个体称为病毒粒子（毒粒），病毒粒子是一种包括核酸和结构蛋白或被膜的一个完整病毒粒子是一种包括核酸和结构蛋白或被膜的一个完整的病毒颗粒，其体积大小相差悬殊，绝大多数直径在的病毒颗粒，其体积大小相差悬殊，绝大多

4、数直径在10300 nm之间。其形态多种多样，但基本形态有杆状，之间。其形态多种多样，但基本形态有杆状，如烟草花叶病毒（如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）呈直杆）呈直杆状，腺病毒（状，腺病毒（adenovirus）呈球形，蝌蚪状为大部分噬）呈球形，蝌蚪状为大部分噬菌体的典型形态，如菌体的典型形态，如噬菌体和噬菌体和T偶数噬菌体均为蝌蚪形偶数噬菌体均为蝌蚪形（图（图81）。基本结构基本结构 核心核心 + 衣壳（核衣壳）衣壳（核衣壳） 核心核心：DNA或或RNA 衣壳衣壳由许多蛋白质亚单位由许多蛋白质亚单位衣壳体衣壳体以对称的形式，规则以对称的形式，规则排列而成。排

5、列而成。 有的病毒在有的病毒在核衣壳核衣壳外还有外还有囊膜、包膜、被膜、外膜等囊膜、包膜、被膜、外膜等结构，膜的表面还有突起：结构，膜的表面还有突起：刺突、囊膜粒等。刺突、囊膜粒等。8.1.2 病毒的基因组病毒的基因组 已知病毒基因组的结构类型多种多样，根据病毒基因已知病毒基因组的结构类型多种多样，根据病毒基因组的结构、以及其转录组的结构、以及其转录mRNA、指导蛋白质合成与病毒复、指导蛋白质合成与病毒复制表达的特点，基本上可以将其分成制表达的特点，基本上可以将其分成6种类型：种类型： 双链（双链（ds）DNA病毒基因组病毒基因组 单链（单链（ss） DNA病毒基因组病毒基因组 正链（正链（+

6、）RNA病毒基因组病毒基因组 负链（负链（-） RNA病毒基因组病毒基因组 双链（双链（ds） RNA病毒基因组病毒基因组 反转录病毒基因组反转录病毒基因组 不同病毒的核酸含量差别较大，通常在不同病毒的核酸含量差别较大，通常在1% 50% 。 但对每种病毒粒子而言，核酸的长度是一定的，一般由但对每种病毒粒子而言，核酸的长度是一定的，一般由5500 kb组成。组成。 最大的病毒基因组有几百个基因最大的病毒基因组有几百个基因 最小的病毒如最小的病毒如M S2噬菌体仅有噬菌体仅有3个基因个基因 病毒基因组编码的基因一般有：侵染功能所需的基因，如病毒基因组编码的基因一般有：侵染功能所需的基因，如侵染中

7、的酶侵染中的酶；基因组复制所需的基因，如；基因组复制所需的基因，如聚合酶基因聚合酶基因；病毒；病毒体形成的基因，如体形成的基因，如衣壳蛋白基因衣壳蛋白基因；破坏宿主细胞的基因，如；破坏宿主细胞的基因，如溶菌酶基因溶菌酶基因；有些病毒生活周期中任何特殊方面所需的基因，；有些病毒生活周期中任何特殊方面所需的基因，如如噬菌体基因组与宿主基因组之间的位点专一性重组所需的噬菌体基因组与宿主基因组之间的位点专一性重组所需的基因等。基因等。8.2 噬菌体的增殖与突变型噬菌体的增殖与突变型8.2.1 噬菌体的增殖噬菌体的增殖 （1）烈性噬菌体（）烈性噬菌体（virulent phage）的增殖）的增殖:感染宿

8、主细感染宿主细胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。整个过程包括：整个过程包括： 吸附吸附 侵入侵入 脱壳脱壳 生物合成生物合成 装配和释放装配和释放（2）温和噬菌体的增殖）温和噬菌体的增殖其感染周期有两种途径：其感染周期有两种途径：即裂解途径和溶源途径，即裂解途径和溶源途径，分别称为裂解周期分别称为裂解周期（lytic cycle）和溶源周期（和溶源周期（lysogenic cycle）8.2.2 噬菌体的突变型噬菌体的突变型（1）条件致死突变型）条件致死突变型 在某些条件下，导致某些突变型致死。那么这些条件就称为限制在某些条件下，导致某些突变型致死。那么这

9、些条件就称为限制条件，而在另一些条件下仍可进行增殖，从而得以扩增进行研究，条件，而在另一些条件下仍可进行增殖，从而得以扩增进行研究，所以这些条件称为许可条件。所以这些条件称为许可条件。温度敏感突变温度敏感突变（temperature sensitive mutation，ts），野生型噬菌体能），野生型噬菌体能在很大的温度变化范围内感染宿主并进行繁殖，而热敏感突变型（在很大的温度变化范围内感染宿主并进行繁殖，而热敏感突变型（heat sensitive mutant，hs），通常在），通常在30（许可条件）感染宿主进行繁殖，但（许可条件）感染宿主进行繁殖，但在在4042（限制条件）就是致死的，

10、不能形成噬菌斑；而冷敏感突变型（限制条件）就是致死的，不能形成噬菌斑；而冷敏感突变型（cold sensitive mutant，cs）在较低温度下就致死。）在较低温度下就致死。抑制因子敏感突变抑制因子敏感突变（suppressor sensitive mutation，sus），），sus突变的实突变的实质是原来正常的密码子变成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成质是原来正常的密码子变成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质。带有完整肽链而产生有活性的蛋白质。带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因（制基因（suppresso

11、r，su）（许可条件）的宿主菌时能产生子代，但在感）（许可条件）的宿主菌时能产生子代，但在感染另一种没有抑制基因（染另一种没有抑制基因（su）（限制条件）的宿主菌时，不能产生子代。）（限制条件）的宿主菌时，不能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。 根据在带有专一性抑制基因的宿主中的非致死性，根据在带有专一性抑制基因的宿主中的非致死性，可以将可以将sus突变分为突变分为3类：琥珀突变（类：琥珀突变（amber，amb）、赭）、赭石突变（石突变（ochre，och）和乳白突变（）和乳白突变（opal，op），它们），它们相应的密码子为相应的密码

12、子为UAG、UAA 和和UGA 终止密码子不编码任何氨基酸，称为无义密码子（终止密码子不编码任何氨基酸，称为无义密码子（nonsense codon），是蛋白质合成的终止信号。这些密码子是琥珀型），是蛋白质合成的终止信号。这些密码子是琥珀型（amber ）UAG、赭石型（、赭石型（ochre）UAA 和乳白型（和乳白型（opal ）UGA。如果编码多肽链中某一氨基酸的密码子突变为终止密码。如果编码多肽链中某一氨基酸的密码子突变为终止密码子，多肽链合成到此便会中断，从而使多肽链变短而失去活性。子，多肽链合成到此便会中断，从而使多肽链变短而失去活性。这种突变称为无义突变（这种突变称为无义突变（no

13、nsense mutation）。各种无义突变都）。各种无义突变都是条件致死突变，因为有相应的无义抑制基因（是条件致死突变，因为有相应的无义抑制基因（su）。）。 这些这些sus突变型之所以在带有相应的抑制基因宿主中可产生后突变型之所以在带有相应的抑制基因宿主中可产生后代，是因为翻译过程中，在终止密码子处插入一个特定的氨基酸，代，是因为翻译过程中，在终止密码子处插入一个特定的氨基酸，防止在终止密码子位置上提前终止。如琥珀突变就有许多种抑制防止在终止密码子位置上提前终止。如琥珀突变就有许多种抑制基因，各插入某个氨基酸以防止提前终止（表基因，各插入某个氨基酸以防止提前终止（表8 -3）。）。 携带

14、携带su突变型的菌株实质是突变型的菌株实质是tRNA基因发生了突变，例如表基因发生了突变，例如表83中的琥珀型抑制基因中的琥珀型抑制基因su3在在UAG密码子上插入了一个酪氨酸，这是密码子上插入了一个酪氨酸，这是因为因为tRNATyr基因的反密码子的一个突变，基因的反密码子的一个突变，tRNATyr正常的反密码子正常的反密码子是是GUA，它按摆动规则译读酪氨酸密码子，它按摆动规则译读酪氨酸密码子UAuc。su3菌株的菌株的tRNATyr含有反密码子含有反密码子CUG，它识读琥珀型密码子，它识读琥珀型密码子UAG，并插入酪，并插入酪氨酸而防止终止。即使抑制基因可在相应的终止密码子处插入一个氨酸而

15、防止终止。即使抑制基因可在相应的终止密码子处插入一个特定的氨基酸而防止提前终止，但合成蛋白质的量也只有相应野生特定的氨基酸而防止提前终止，但合成蛋白质的量也只有相应野生型的型的5% 55%（表（表83）（2）噬菌斑形态和宿主范围的突变型）噬菌斑形态和宿主范围的突变型 噬菌斑形态突变型噬菌斑形态突变型 这类突变往往是致死的，受控制的基因这类突变往往是致死的，受控制的基因大都位于基因组中狭窄的特定的区段里，而噬菌体大多数基因都大都位于基因组中狭窄的特定的区段里，而噬菌体大多数基因都涉及生命过程不可缺少的功能。但突变后有的是由于侵染宿主细涉及生命过程不可缺少的功能。但突变后有的是由于侵染宿主细胞后溶

16、菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑（胞后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑（plaque）。另一）。另一些则是由于被感染细菌全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的些则是由于被感染细菌全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。噬菌斑。 一般说来烈性噬菌体（一般说来烈性噬菌体（ virulent phage） ，如，如T2、T4以及以及 X174等形成清晰噬菌斑（等形成清晰噬菌斑（ clear plaque） ，而温和噬菌体，而温和噬菌体（ temperate phage） ，如，如 和和P1等则形成混浊的噬菌斑等则形成混浊的噬菌斑（ turbid plaque）。）。 宿主范围的突变型宿主范围

17、的突变型 噬菌体感染细菌时，首先吸附于细噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面的专一受体上，这是由受体的基因控制的，如果受体胞表面的专一受体上，这是由受体的基因控制的，如果受体发生改变，有可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的宿主发生改变，有可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的宿主范围就缩小，另外，噬菌体突变也可以扩大寄生范围。尽管范围就缩小，另外，噬菌体突变也可以扩大寄生范围。尽管这些突变通常是致死的，不能形成噬菌斑，但有些突变在限这些突变通常是致死的，不能形成噬菌斑，但有些突变在限制的宿主中是致死的，而在许可的宿主中则可形成噬菌斑。制的宿主中是致死的，而在许可的宿主中则可形成噬菌斑。因而宿主范

18、围的突变型其本质也是条件致死突变型之一。因而宿主范围的突变型其本质也是条件致死突变型之一。 Benzer所用的所用的T4的的r 突变就是一个条件致死突变型。突变就是一个条件致死突变型。 T4 r 突变使所侵染细胞迅速裂解形成大的噬菌体，即快突变使所侵染细胞迅速裂解形成大的噬菌体，即快速溶菌突变体（速溶菌突变体（ rapid lysis mutant） ，这些突变体命名为，这些突变体命名为r，所以称为所以称为r 突变型。突变型。T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为别称为r ， r ， r 等，它们位于等，它们位于T4染色体染色体DNA的不同区的不同区段，这段，这

19、3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以相互区别（表相互区别（表8- 4） 。8.3 噬菌体突变型的重组测验噬菌体突变型的重组测验8.3.1 Benzer的重组测验与基因的精细结构分析的重组测验与基因的精细结构分析(1)噬菌体的杂交和重组慨念噬菌体的杂交和重组慨念 野生型噬菌体野生型噬菌体 突变型突变型 用两种突变型噬菌体感染同一宿主细菌，叫混合感染用两种突变型噬菌体感染同一宿主细菌，叫混合感染（mixed infection）或双感染（）或双感染（double infection）进入进入裂解周期裂解周期两个噬菌体偶然地发生交换两个噬菌体

20、偶然地发生交换它们的后裔可它们的后裔可以出现重组子。以出现重组子。 因此可以进行染色体作图分析。因此可以进行染色体作图分析。(2)基因的精细作图基因的精细作图基因内重组基因内重组 （Intragenic recombination)基本原理如图所示基本原理如图所示: 虽然基因内重组能够发生，但实验很难做，因为在虽然基因内重组能够发生，但实验很难做，因为在两个相同基因内的两个突变间的距离非常短，在这样一两个相同基因内的两个突变间的距离非常短，在这样一个极其小的区域，产生重组染色体的可能性仅个极其小的区域，产生重组染色体的可能性仅1105。真核生物如果蝇、植物这样低的频率是无法从实验上得真核生物如

21、果蝇、植物这样低的频率是无法从实验上得到的。到的。r突变型品系，在突变型品系，在E.coli中的不同表型提供了一中的不同表型提供了一个实验系统，可以检测到个实验系统，可以检测到1106的重组子。的重组子。1955年年Benzer：细菌噬菌体遗传区的精细结构细菌噬菌体遗传区的精细结构1、分离两个不同的（非互补的）、分离两个不同的（非互补的）r噬菌体突变子噬菌体突变子2、共感染、共感染E.coli B，形成噬菌体的新群体，形成噬菌体的新群体，E.coli B细胞逐渐细胞逐渐裂解。裂解。3、收集裂解液，和、收集裂解液，和E.coli K菌株混合后倒在固体平板上菌株混合后倒在固体平板上4、取一些噬菌体

22、、取一些噬菌体 稀释到稀释到108，感染，感染E.coli B，也取一些噬，也取一些噬菌体菌体稀释到稀释到103，感染，感染E.coli K12 ()5、涂布细胞，观察噬菌斑的数目、涂布细胞，观察噬菌斑的数目 Benzer利用利用T4的两个的两个r不同突变型如不同突变型如r47和和r104在许可在许可条件下进行双重感染，即条件下进行双重感染，即r47和和r104同时侵染大肠杆菌同时侵染大肠杆菌B菌株，形菌株，形成噬菌斑后收集溶菌液，将此溶菌液等分两份，一份再接种大成噬菌斑后收集溶菌液，将此溶菌液等分两份，一份再接种大肠杆菌肠杆菌B菌株，在大肠杆菌菌株，在大肠杆菌B菌株的细胞中菌株的细胞中r47

23、、r104、r47r104、都能生长，故在此平板上可统计噬菌体总数；另一份溶液都能生长，故在此平板上可统计噬菌体总数；另一份溶液接种于大肠杆菌接种于大肠杆菌K（）菌株中倒平板，在这里，只有重组）菌株中倒平板，在这里，只有重组子才能生长（图子才能生长（图8-4），由于），由于r双重突变的交互重组子双重突变的交互重组子r47r104不不能生长，所以无法检出，但是它的频率和相等，因此估算能生长，所以无法检出，但是它的频率和相等，因此估算重组子数要将数乘以重组子数要将数乘以2，代入公式：，代入公式：1955年年Benzer：细菌噬菌体遗传区的精细结构细菌噬菌体遗传区的精细结构分离两个不同的（非互补的）

24、分离两个不同的（非互补的）r噬菌体突变子噬菌体突变子 因此可用以下公式计算相邻因此可用以下公式计算相邻不同位点的遗传距离：不同位点的遗传距离： 由于在由于在E.coli B平板感染后得平板感染后得到的噬菌斑数为群体总数，在到的噬菌斑数为群体总数，在E.coli K12 ()的噬菌斑为基因内的噬菌斑为基因内重组所得到的野生型的噬菌体数，重组所得到的野生型的噬菌体数，所以以上公式可以表示为：所以以上公式可以表示为： 这一测定方法称为重组测验（这一测定方法称为重组测验（recombination test ），它），它是以遗传图的方式确定突变子之间的空间关系是以遗传图的方式确定突变子之间的空间关系（

25、图（图8-5）。）。 根据公式根据公式 重组频率重组频率2（1103）/ 6.6109 3.3106 0.0000033 （一百万分之（一百万分之3.3） 作图显示作图显示r+重组子最低频率，在重组子最低频率，在r突变子中带有的异突变子中带有的异点等位突变是点等位突变是0.01%，最小的图距，最小的图距0.01%来对两个标记间的分来对两个标记间的分子距离子距离以碱基对表示的距离以碱基对表示的距离做一个粗略地估计。做一个粗略地估计。 可检测到两个可检测到两个r突变之间重组率为突变之间重组率为0.000 2%（211062106）。但实际上所观察的最小重组率为）。但实际上所观察的最小重组率为0.0

26、2% ，即，即0.02个图距单位，还没有发现小于这个数值的重组率（图个图距单位，还没有发现小于这个数值的重组率（图8-6） 以前用来计算重组的方法是计算基因与基因之以前用来计算重组的方法是计算基因与基因之间的距离，而间的距离，而Benzer的方法可以用来测算一个基因的方法可以用来测算一个基因内部不同位点的距离，它的精确度可达到十万分之内部不同位点的距离，它的精确度可达到十万分之一，也就是一，也就是0.001个图距单位，故称作基因的精细个图距单位，故称作基因的精细作图。作图。例：噬菌体例：噬菌体T41500 map units (1.8105bp) 如果两个如果两个r突变子产生突变子产生0.01

27、% r +突变子，则意味突变是由突变子，则意味突变是由0.02图图单位所分开。单位所分开。 占整个占整个T4 Genome: 0.02/1500 = 1.3105 T4 phage 有：有：1.8105bp 所观察到的最小重组距离：所观察到的最小重组距离： （1.3105）（1.8105）2.4 bp 这意味这意味Benzers结果已显示遗传重组可能出现在结果已显示遗传重组可能出现在2个碱基对顺序个碱基对顺序的距离内，后来由其他人的实验已做出结论性的说明，重组可出现的距离内，后来由其他人的实验已做出结论性的说明，重组可出现在影响在影响DNA中邻近碱基对的突变之间。中邻近碱基对的突变之间。也就是

28、说：也就是说：遗传实验已经说明碱基对遗传实验已经说明碱基对 既是既是 突变单位（突变单位（unit of mutation） 也是也是 重组单位（重组单位（unite of recombination）(3) 基因的基本概念基因的基本概念 经典遗传学基因概念经典遗传学基因概念：基因是一个基本的结构单位，基因内：基因是一个基本的结构单位，基因内不发生重组；基因是一个基本的突变单位，基因内部没有更小不发生重组；基因是一个基本的突变单位，基因内部没有更小的突变发生；基因是一个基本的功能单位，它决定着一个特定的突变发生；基因是一个基本的功能单位，它决定着一个特定的表型性状。的表型性状。即：即：基因是一

29、个重组、突变和功能三位一体的单位。基因是一个重组、突变和功能三位一体的单位。现代遗传学基因概念现代遗传学基因概念：Gene (Cistron) is the segment of DNA involved in producing a polypeptide Chain；it includes regions proceeding and following the coding region (leader and trailer) as well as intervening sequences (introns) between individual coding segments(ex

30、ons)。 基因内部可以发生重组，基因内部可以发生更小的突变基因内部可以发生重组，基因内部可以发生更小的突变 一些基因可被转录但不被翻译，如一些基因可被转录但不被翻译，如rRNA，tRNA等；等； 一些既被转录也被翻译，如一些既被转录也被翻译，如Structural gene等。等。 例题例题：有两个：有两个T4噬菌体的噬菌体的r突变体同时感染突变体同时感染E.coli后裂解，后裂解，将其裂解液稀释成将其裂解液稀释成610-7感染感染E.coli B菌株后做成平板，产生菌株后做成平板，产生18个噬菌斑，另一种稀释液浓度为个噬菌斑，另一种稀释液浓度为210-5感染感染E.coli K菌株，菌株，

31、做平板得做平板得14个噬菌斑，请你计算此两个基因之间的重组值。个噬菌斑，请你计算此两个基因之间的重组值。为比较为比较B、K上的噬菌斑数目，由于稀释浓度不同，必须校正，上的噬菌斑数目，由于稀释浓度不同，必须校正，所以在所以在610-7稀释液中产生稀释液中产生18个噬菌斑，则在个噬菌斑，则在210-5稀释液稀释液中产生的噬菌斑为：中产生的噬菌斑为： 18 210-5 610-7= 18100/3 = 600即相当于在即相当于在210-5稀释液中可以产生稀释液中可以产生600个噬菌斑。个噬菌斑。因此，重组值因此，重组值 = 214/600 100% = 4.67%8.3.2 T2突变型的两点测交与作

32、图突变型的两点测交与作图 检验噬菌体中基因重组的前提必须要有突变型，而不同突检验噬菌体中基因重组的前提必须要有突变型，而不同突变型之间的基因重组首先是在噬菌体变型之间的基因重组首先是在噬菌体T2中发现的。中发现的。 T2噬菌体突变型（噬菌体突变型（ r ）是快速溶菌，产生大的、界限分）是快速溶菌，产生大的、界限分明的噬菌斑，而野生型（明的噬菌斑，而野生型（ r ）是缓慢溶菌产生小噬菌斑；）是缓慢溶菌产生小噬菌斑； 宿主范围突变型宿主范围突变型（ h ）能感染大肠杆菌品系）能感染大肠杆菌品系1和品系和品系2，产生透明的噬菌斑，而野生型（产生透明的噬菌斑，而野生型（ h ）只能感染品系）只能感染品

33、系1，因为，因为品系品系2的细胞表面能阻止的细胞表面能阻止T2噬菌体对它的吸附。噬菌体对它的吸附。 所以把所以把T2噬菌体接种到大肠杆菌品系噬菌体接种到大肠杆菌品系1和和2的混合培养物的混合培养物上时，噬菌斑是半透明的。上时，噬菌斑是半透明的。 将将h r 与与h r 同时感染大肠杆菌品系同时感染大肠杆菌品系1，两种噬菌体都，两种噬菌体都可以在品系可以在品系1细菌细胞中进行增细菌细胞中进行增殖，同时也可能发生重组。殖，同时也可能发生重组。 为了检验这两个基因位点之间是否发生重组，将其子代噬为了检验这两个基因位点之间是否发生重组，将其子代噬菌体再去侵染大肠杆菌品系菌体再去侵染大肠杆菌品系1和品系

34、和品系2的混合培养物，结果出现的混合培养物，结果出现4种而不是种而不是2种噬菌斑，既有亲本类型：种噬菌斑，既有亲本类型：大而半透明的大而半透明的h r 和和小而透明的小而透明的 h r ；还有；还有重组类型：重组类型：小小而半透明的而半透明的 h r 和和大而大而透明的透明的h r 分别统计各种噬菌斑的数目，由此计算出重组值，去掉分别统计各种噬菌斑的数目，由此计算出重组值，去掉% ，作为图距进行作图。作为图距进行作图。 不同速溶性噬菌体的突变在表型上不同，可分别写成不同速溶性噬菌体的突变在表型上不同，可分别写成ra、rb、rc等，用等，用hrxhrx获得的试验结果如下：获得的试验结果如下： 根

35、据表根据表8-5结果可以分别作出以下结果可以分别作出以下ra、rb 、rc与与h之间的之间的3个个顺序：顺序： 由于有由于有3个不同的个不同的r基因，故可根据表基因，故可根据表8-5的重组值列出以下的重组值列出以下4种可能的基因排列连锁图：种可能的基因排列连锁图：我们如何选出正确的排列？我们如何选出正确的排列？首先只考虑首先只考虑rb，rc和和h rc-h-rb h-rc-rb要进行要进行rc rb+ rc+rb 的杂交，得到的重组值与的杂交，得到的重组值与rb-h间的间的距离进行比较，若距离进行比较，若rc-rb12.3=rb-h，则，则h位于中间，即排列位于中间，即排列顺序为顺序为rc-h

36、-rb。剩下的是剩下的是ra在在h的哪一边？的哪一边？这需做广泛的遗传学作用，这需做广泛的遗传学作用，答案是答案是ra-rc-h-rb和和rc-h-rb-ra都正确，都正确，因为因为T2噬菌体的连锁图也是环状的。噬菌体的连锁图也是环状的。？8.3.3 噬菌体的基因重组与作图噬菌体的基因重组与作图 Kaiser 1955年最早进行了年最早进行了噬菌体的重组作图试验。他用噬菌体的重组作图试验。他用紫外线照射处理得到紫外线照射处理得到5个个噬菌体的突变系：噬菌体的突变系： s 系产生小噬菌斑系产生小噬菌斑 mi系产生微小噬菌斑系产生微小噬菌斑 c 系产生完全清亮的噬菌斑系产生完全清亮的噬菌斑 co1

37、系产生除中央一个环之外其余部分都清亮的噬菌斑系产生除中央一个环之外其余部分都清亮的噬菌斑 co2系产生比系产生比co1更浓密的中央环噬菌斑。更浓密的中央环噬菌斑。 Kaiser用用s co1 mi 杂交，所得后代有杂交，所得后代有8种类型。种类型。病病毒是单倍体，与二倍体生物不同，亲本组合与重组交换的组毒是单倍体，与二倍体生物不同，亲本组合与重组交换的组合可直接从后代中反映出来。合可直接从后代中反映出来。8个类型中数目最少的两种类型个类型中数目最少的两种类型就是双交换的结果，频率最高的两种是亲本类型，其余的为就是双交换的结果，频率最高的两种是亲本类型，其余的为单交换类型。结果及分析作图可归纳于

38、表单交换类型。结果及分析作图可归纳于表86。 从双交换的类型可知，这从双交换的类型可知，这3个基因的次序就是个基因的次序就是sco1mi s与与co1的图距应为的图距应为3.83 cM；co1 与与mi之间则为之间则为6.21 cM；因为有；因为有双交换的存在，双交换的存在，s与与mi之间的图距则为之间的图距则为8.3220.8610.043个基因的遗传图个基因的遗传图:8.3.4 T4 突变型的三点测交与作图突变型的三点测交与作图 采用三点测交的方法，在噬菌体中同样可进行基因定位。采用三点测交的方法，在噬菌体中同样可进行基因定位。用用T4噬菌体的两个品系感染噬菌体的两个品系感染E. coli

39、。一个品系。一个品系:m r tu（小噬菌（小噬菌斑、快速溶菌浑浊溶菌斑）突变型。另一个品系对这斑、快速溶菌浑浊溶菌斑）突变型。另一个品系对这3个性状个性状都是野生型（）的。三点测交结果见表都是野生型（）的。三点测交结果见表87：根据上述结果，可绘出这根据上述结果，可绘出这3个基因的染色体图：个基因的染色体图： 并发系数并发系数 = 0.033/（0.129 0.208）= 1.2 并发系数大于并发系数大于1，为负干涉。，为负干涉。 其主要原因在于：其主要原因在于：（1）与噬菌体）与噬菌体DNA结构特点相关（裸露，不与组蛋白结合）；结构特点相关（裸露，不与组蛋白结合）；（2）与杂种）与杂种DN

40、A分子的基因转变相关。分子的基因转变相关。 三点测交所得三点测交所得8种噬菌斑都可观察到，单倍体的病毒、亲本种噬菌斑都可观察到，单倍体的病毒、亲本型与重组型可直接从后代中表现出。型与重组型可直接从后代中表现出。 虽然将真核生物中两点测交和三点测交的基本原理和方法应虽然将真核生物中两点测交和三点测交的基本原理和方法应用于噬菌体杂交，但是两者在杂交机制上是完全不同的：用于噬菌体杂交，但是两者在杂交机制上是完全不同的：噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于感染细菌时每种亲代噬菌体的相对数量。如基因型感染细菌时每种亲代噬菌体的相对数量。

41、如基因型A与基因型与基因型B的亲代比的亲代比10：1，则产生重组子代的数量，则产生重组子代的数量A型常多于型常多于B型子代型子代数。数。噬菌体的基因重组发生在噬菌体的噬菌体的基因重组发生在噬菌体的DNA复制以后，因此从单复制以后，因此从单个混合感染的细菌中可以得到亲代噬菌体和重组噬菌体；个混合感染的细菌中可以得到亲代噬菌体和重组噬菌体；噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换在噬菌体中基因重组率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而在噬菌体中基因重组率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而增加。增加。因此噬菌体杂交时，应该注意：因此噬菌体杂交时，应该注意：控制控制每种亲代噬

42、菌体基因型的每种亲代噬菌体基因型的投放量投放量。控制允许发生复制和重组的时间控制允许发生复制和重组的时间。只有控制这两个因素并在标准条件下进行杂交所只有控制这两个因素并在标准条件下进行杂交所, 得重组率才得重组率才能用于绘制近似的遗传图能用于绘制近似的遗传图8.4 互补测验与顺反子互补测验与顺反子 遗传学研究的基础必须有突变型，然后分析这些突变型之遗传学研究的基础必须有突变型，然后分析这些突变型之间的关系。重组测验与互补测验是确定这种关系性质的两个间的关系。重组测验与互补测验是确定这种关系性质的两个基本方法。已知重组测验是以遗传图距的方式确定基因的空基本方法。已知重组测验是以遗传图距的方式确定

43、基因的空间关系，而互补测验（间关系，而互补测验（ complementation test ）则是确定突变）则是确定突变基因的功能关系。基因的功能关系。 为了界定基因的功能单位，必须进行互补测验。为了界定基因的功能单位，必须进行互补测验。1957年年Benzer以大肠杆菌以大肠杆菌T4噬菌体为材料，通过互补实验，在噬菌体为材料，通过互补实验，在DNA分子水平上，研究快速溶菌突变型分子水平上，研究快速溶菌突变型r的基因精细结构。的基因精细结构。 如如T4噬菌体的噬菌体的r 区中有区中有3 000多个突变，多个突变，它们都有相同的表型，这是由于所有的它们都有相同的表型，这是由于所有的r 突变都导致

44、丧失合成大肠杆菌突变都导致丧失合成大肠杆菌K（）发育）发育所需要的一种或几种蛋白质的能力，因此所需要的一种或几种蛋白质的能力，因此这些突变型对大肠杆菌这些突变型对大肠杆菌K（）宿主细胞是）宿主细胞是致死的，但可以在大肠杆菌致死的，但可以在大肠杆菌B菌株的细胞中菌株的细胞中增殖。既然它们有相同的表型，那么是否增殖。既然它们有相同的表型，那么是否它们都影响同一遗传功能？它们都影响同一遗传功能？ 即即r 中这中这3 000多个突变是属于一个基因还是属于几个多个突变是属于一个基因还是属于几个基因？基因？ 为了界定基因的功能单位，必须进为了界定基因的功能单位，必须进行互补测验行互补测验，即用，即用T4不

45、同的不同的r 突变型成突变型成对组合同时感染大肠杆菌对组合同时感染大肠杆菌K（）菌株。）菌株。如如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体，那么就必然是一个突变型的子代噬菌体，那么就必然是一个突变补偿了另一个突变所不具有的功能，这两补偿了另一个突变所不具有的功能，这两个突变就称为彼此互补个突变就称为彼此互补（ complementation） 。如果双重感染的。如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变一定有一个相同功能受到损伤一定有一个相同功能受到损伤 所谓互补作用是指二个突变型染色体同处在一个细胞中，

46、所谓互补作用是指二个突变型染色体同处在一个细胞中，由于相对的野生型基因的互相补偿而使表型正常化的作用。由于相对的野生型基因的互相补偿而使表型正常化的作用。 进行互补测验（进行互补测验（complementation tests）必须是二个突变型）必须是二个突变型染色体同处在一个细胞中（二倍体或部分二倍体合子），而且染色体同处在一个细胞中（二倍体或部分二倍体合子），而且它们之间不发生重组或者只发生忽略不计的极少重组，否则将它们之间不发生重组或者只发生忽略不计的极少重组，否则将不能判断表型正常化是重组的结果还是互补的结果。不能判断表型正常化是重组的结果还是互补的结果。 进行互补测验常用斑点测试法（

47、进行互补测验常用斑点测试法（ spot test） 。用一种。用一种r 突突变型以变型以0.1的感染比（噬菌体的感染比（噬菌体1细菌细菌10）去感染大肠杆菌）去感染大肠杆菌K（）菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在营养平板上，菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在营养平板上，琼脂凝固后，在平板上所划出的一定位置上再加一滴含有另一琼脂凝固后，在平板上所划出的一定位置上再加一滴含有另一种种r 突变型的培养基，在这一滴培养基的范围内，一些细菌就突变型的培养基，在这一滴培养基的范围内，一些细菌就会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌斑，就证明这会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬

48、菌斑，就证明这两种突变型互补，相反就不能互补。两种突变型互补，相反就不能互补。 互补测验的结果发现，除了一些缺失突变型外，互补测验的结果发现，除了一些缺失突变型外， r 突突变型可分成变型可分成r A 和和r B两个互补群。所有两个互补群。所有r A突变型的突突变型的突变位点都在变位点都在r 区的一端，是一个独立的功能单位；所有区的一端，是一个独立的功能单位；所有r B突变型的突变位点都在突变型的突变位点都在r 区的另一头，也是一个独立的区的另一头，也是一个独立的功能单位。凡是属于功能单位。凡是属于r A的突变之间不能互补，同理属于的突变之间不能互补，同理属于r B的突变之间也不能互补，只的突

49、变之间也不能互补，只r A的突变和的突变和r B的突变的突变之间可以互补，即双重感染大肠杆菌之间可以互补，即双重感染大肠杆菌K（）菌株后可产生子）菌株后可产生子代。说明代。说明r A和和r B是两个独立的功能单位，分别具有不是两个独立的功能单位，分别具有不同的功能，但它们的功能又是互补的，要在大肠杆菌同的功能，但它们的功能又是互补的，要在大肠杆菌K（）菌株中增殖，这两种功能缺一不可。由此可见，菌株中增殖，这两种功能缺一不可。由此可见， r 是由于是由于这两种遗传功能丧失而形成的。这两种遗传功能丧失而形成的。 互补测验又称为顺反测验互补测验又称为顺反测验（ cis-trans test），所用的

50、两个突），所用的两个突变如果分别位于两条染色体上，这种组合方式称为反式排列，如变如果分别位于两条染色体上，这种组合方式称为反式排列，如果两个突变同时位于一条染色体上，则称为顺式排列。就是用这果两个突变同时位于一条染色体上，则称为顺式排列。就是用这种反式构型检验突变之间的关系。如两个隐性突变表现出互补效种反式构型检验突变之间的关系。如两个隐性突变表现出互补效应，则证明这两个突变分别属于不同基因；如不能表现出互补，应，则证明这两个突变分别属于不同基因；如不能表现出互补，则证明这两个突变是在同一基因内。顺式排列只是作为对照，因则证明这两个突变是在同一基因内。顺式排列只是作为对照，因为在顺式排列中，不