两种植物组织特异性基因表达方法分析.docx

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1、 两种植物组织特异性基因表达方法分析两种植物组织特异性基因表达方法分析多细胞生物体内存在不同类型的器官、组织、细胞，它们有各自的特性，担负着不同的功能。例如，植物根表皮中的根毛细胞，主要负责从周围土壤中吸收水分与矿质营养。与这一功能相适应，它们在发育过程中向外突起形成管状结构以增加其表面积和吸收水分、养分的能力;植物根里的内皮层细胞在发育过程中通过特殊的细胞壁加厚和特定部位胼胝质的沉积形成 凯氏带 ,阻止矿质养分向维管束和地上部分渗透，控制皮层和维管柱之间的物质运输;在茎和叶片中，保卫细胞可以调节内部叶肉细胞与外部环境之间的气体交换，这一过程需要依赖周围细胞通过 K 离子交换来创造一个调节气孔

2、关闭与打开的膨压。这些不同类型器官、组织、细胞的形成，以及它们之间功能的差异，在很大程度上取决于特异性表达的基因。因此，研究不同器官、组织、细胞中呈特异性表达的基因，对了解植物生长发育调控机理，细胞类型与功能之间的关系都有重要意义。此外，研究组织特异性表达的基因的调控机理，可帮助我们构建植物组织特异性表达体系，有目的地在特定器官、组织、细胞中表达特定靶基因，以便进行靶基因功能分析。组织特异性表达技术在植物基因工程中具有一定的应用前景，如利用植物的特定组织细胞合成所需要的代谢产物，还可以用于作物改良的基因工程等。组织特异性表达技术是近年来植物学研究中的一个重要领域。主要介绍目前被广泛使用的两种植

3、物组织特异性基因表达方法，即特定启动子驱动法和 GAL4UAS 激活标签法。第 1 页 共 13 页 1 组织特异性启动子驱动法1.1 植物组织特异性启动子启动子是一段位于功能基因 5 端上游的 DNA 序列，包含特定的保守序列，长度因基因而异。启动子上的多种顺式作用元件能识别 RNA聚合酶，并指导相应类型的 RNA 聚合酶与模板正确结合，形成转录起始复合体，控制转录的时空特性和强度，从而精确有效地启动基因的表达。有些启动子，如花椰菜花叶病毒 35S 启动子、水稻 Atin1 基因的 At1 启动子和玉米 Ubiquitin 基因的 Ubi 启动子等，其调控的基因不受时空及外界因素的影响，几乎

4、在植物所有组织都有表达，而且表达水平在不同组织部位没有明显差异，被称之为组成型启动子或非特异性表达启动子。组织特异性启动子，又称为器官特异性启动子或细胞特异性启动子，则不同于组成型启动子，其所控制的基因只在或主要在特定的组织中表达。除具有一般启动子的特性外，组织特异启动子还具有一些调控目的基因特异表达的调控元件，这些调控元件的位置、数目、种类决定了目的基因表达的时空专一性，是基因特异表达所必需的。因此，组织特异型启动子已成为转基因研究中常用的外源基因的启动元件。目前研究人员已经在不同植物中分离并证实了多种具有组织表达特异性的启动子，按照其驱动基因的表达部位，可分为植物营养器官，如根、块茎、维管

5、组织和茎叶绿色组织等表达的组织特异性启动子，植物生殖器官如花器、果实和种子表达的组织特异性启动子。根据调控的组织特异性基因表达模式是否受光、热等条件的诱导，又可分为可诱导和无需诱导的组织特异性启动子，比如水稻绿色组织特异第 2 页 共 13 页 表达的 Ra 基因和 LP2 基因的启动子要受到光的诱导。研究人员也发现，许多植物的内含子也有调控基因时空表达的作用，例如拟南芥花同源基因 AGAMOUS 中内含子中有增强子序列，它和该基因在花器官中的特异区域表达相关。水稻 OsTubA1 基因由 4 个外显子和 3 个内含子组成，在不同的组织如根尖、幼叶和花中有表达，而这一表达模式需要第一个内含子的

6、调控。矮牵牛花 PhADF1 基因中第 1 个内含子会增强其在维管组织的特异性高表达，后来研究证明，这一内含子改变PhADF1 基因组织特异性表达的过程是一种转录后调控机制，而且进化比较保守。1.2 植物组织特异性启动子的一般研究方法研究植物的启动子一般采用如下手段，首先通过 PCR 扩增法，从植物基因组中扩增已知全部或部分序列的启动子片段，然后通过 PLACE和 PLANTCARE 网站，对得到的启动子片段进行生物信息学分析，预测启动子的核心结构和功能，并在启动子片段的后面融合 GUS 和 GFP 等报告基因，通过瞬时和稳定的转化，对启动子的表达模式进行分析，最后通过点突变、片段缺失等分析，

7、得到该启动子的核心调控元件。DNA 微阵列的数据给开发新的启动子提供了有利条件。Ye 等人利用水稻 DNA 微阵列数据库 CREP，鉴定得到一个只在绿色组织中特异表达的基因，与水稻基因组数据库中数据进行序列比对发现，该基因编码一个蛋白 DX1.RT-PCR 分析表明，DX1 确实是在叶、叶鞘、茎和穗茎中表达，而在根、花药和胚乳中都没有表达。通过将编码区上游 1505bp 和下游558bp 序列作为该基因的候选启动子，并提交到 PlantCARE 网站与已有数据进行比较分析，采用片段缺失分析和凝胶阻滞实验 EMSA，得到位第 3 页 共 13 页 于 71至 61 的序列 5 CAGGACATA

8、TT3 和位于+1 至+86 的 5ATGAACTCAAA-GAGCC3 的 2 个绿色组织特异的顺式调控元件。点突变分析表明这两个顺式调控元件都是正调控因子。近些年来，由于基因组、转录组学技术和测序技术的快速发展，使得大规模预测启动子序列和找到发挥作用的调控原件变得可行。Verelst 等人通过分析拟南芥花粉的 4 个发育阶段中不同组织的 ATH1基因芯片结果，找到了很多花粉特异表达的基因，启动子分析发现约 29%的 TCP-MPG 类基因启动子中含有一个 MEF2 基序。差异基因表达也常被用来研究组织特异的启动子，通过 DNA-AFLP，得到具有差异表达的转录片段，通过这种方法，在马铃薯中

9、得到了一个具有在块茎和匍匐茎等茎组织特异表达的 StCCS 启动子。转录组测序也有助于非模式物种的差异基因表达研究，Geng 等通过在花生中建立一个基于高通量测序的筛选系统，获得 584 条根特异和 316 条种子特异表达的基因片段，其中的 55.3%和 64.6%经半定量 RT-PCR 验证为组织特异表达基因，并从中分离鉴定了一个根特异表达的启动子 As.1.3 植物组织特异性启动子的应用目前，植物基因工程中使用的多是组成型启动子，其中 CaMV35S启动子主要用于双子叶植物的遗传转化，Ubi 启动子主要用于单子叶植物的遗传转化。虽然这类启动子驱动的基因在转基因植物的不同组织、不同生长阶段均

10、有高水平表达，也易于构建目的基因过表达的载体，但在应用中逐渐暴露出一些问题和局限性。例如，组成型的启动子不能用于研究不同类型细胞和组织的功能，而且靶基因在发育过程第 4 页 共 13 页 的错误时间和错误空间过量表达有时会对植物生长发育产生影响。组成型的基因表达可能会造成转基因植物生长延缓，开花延迟，减产，品质降低，甚至不育等现象。此外，在同一个植物中重复使用同一个组成型启动子驱动多个不同基因表达容易造成基因沉默现象。组织特异性启动子则可克服上述缺点，它们可以驱动外源基因在植物发育过程中某一特定的时空表达，使目的基因的表达产物在特定细胞或组织中积累。伸展作用因子是调控植物生长过程中细胞壁伸长的

11、主要调节因子。在烟草中用拟南芥根系特异表达的启动子 Pk10 驱动型伸展基因 TaEXPB23,不仅增加了侧根的数目，而且与 35S 组成型启动子表达该基因的植株和野生型相比，根系生物量明显提高;在缺水胁迫条件下，与野生型相比，根系特异表达该基因的植株光合速率增加，积累的活性氧更少，具有较高水平的抗氧化酶的活性，使转基因植株的抗胁迫能力提高。植物发达的根系会增加其抗胁迫能力。水稻根系特异表达的 RC3 启动子的分离给提高作物抗胁迫能力和作物产量提供了有效工具。Jeong 等用 RC3 启动子驱动水稻受干旱、高盐和脱落酸等胁迫诱导表达的 OsNAC10 基因，使其在根中过量表达，转基因水稻根直径

12、是非转基因水稻的1.25 倍，根的中柱、皮层和表皮都变大;在干旱胁迫和正常条件下，水稻产量与野生型相比都有不同程度的提高。油菜是世界上广泛种植的油料作物，含有高不饱和的 C18 脂肪酸和低芥酸，具有很高的营养价值。Ellerstrom 等从油菜中分离得到一个只在胚和胚乳特异表达的启动子 napA.利用 napA 驱动调控不饱和脂肪酸合成的 LEC1 和 L1L 基因，使它们在种子中特异表达，转基因植株第 5 页 共 13 页 种子含油量提高 2%20%,但油分品质没有发生明显改变，也没有影响其他主要的农业性状，而且这些改良与作物生长条件无关。木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生

13、理功能，但对于造纸工业而言是有害成分，必须从木纤维中去除，木材中的木质素是形成造纸污染的主要来源。编码咖啡酸酸-O-甲基转移酶相关基因的克隆，使研究者可以下调杨树中 COMT 的含量，通过 RNAi 可以减少转基因杨树中约 90%COMT 活性，木质素的含量没有受到影响，但使木质素的结构发生明显变化，转基因杨树更加适用于纸浆工业。在烟草中用组成型启动子 35S 表达木质素合成途径相关基因肉桂酰辅酶 A 还原酶反义基因虽然可以下调 CCR 基因的表达，减少木质素的含量，但也会影响整个植株的生长发育，出现延迟生长，皱叶等表型;为了克服这样的困难，用维管组织特异表达的启动子 LlCCR 和 LlCA

14、D 可能会避免对整个植株造成的伤害，从而实现特异性地降低木材中木质素的含量，减少造纸工业中为去除木质素而消耗的能源和化学原料。2 GAL4UAS 激活标签法1GAL4UAS 系统简介GAL4UAS 双因子反式激活体系介导的基因异位表达可实现转基因的空间控制，加上适当的修饰可以实现时空双重控制。Brand 和Perrimon 首次在果蝇中构建 GAL4UAS 体系，建立了一个可将任何外源基因以果蝇自身细胞或组织特异的方式被选择性激活表达的系统，并利用该系统来研究果蝇 even-skipped 蛋白的功能。Guer 等将修饰过的GAL4UAS 系统 GAL4C1 首次运用到双子叶模式植物拟南芥中，

15、在植物中建立了 GAL4UAS 外源基因异位表达系统。第 6 页 共 13 页 GAL4UAS 是由酵母的 GAL4 基因和 GAL4 基因的上游激活因子序列UAS 两部分组成。GAL4UAS 系统的建立，首先需要将 GAL4 基因与组织特异性的启动子或增强子相连接，建立以细胞和组织特异性的方式调控表达的 GAL4 转基因系;同时将 UAS 与感兴趣的靶基因融合，建立带有 UAS-靶基因的转基因系。在 UAS-靶基因转基因系中，靶基因只需和UAS 序列相连接，不再需要特定的启动子。因为 GAL4 蛋白只能与 UAS相结合之后才能调控 GAL4 基因的表达，所以只有将 2 个转基因系进行杂交，在

16、杂交后代中，特异性表达的 GAL4 才能以同样的方式调节 UAS-靶基因的表达。为了便于检测 GAL4UAS 系统杂交子代中靶基因表达的位置，通常采用的方式为运用 GUS 和 GFP 等报告基因建立 UAS-靶基因-报告基因，将靶基因的编码区域与报告基因融合，整合到宿主的基因组中;此 UAS转基因系与 GAL4 系杂交后，子代中报告基因由于 GAL4 与 UAS 的结合，伴随着靶基因开始表达，通过检测报告基因在不同细胞中的活性，就可方便地对靶基因的表达模式进行更为准确的分析，再对其表达产生的生物学效应做进一步的研究。此外，为了方便在建立的 GAL4系亲本中提前检测 GAL4 在不同细胞组织中的

17、表达，可将报告基因 GUS或 GFP 融合到 GAL4 片段后，随着 GAL4 随机的插入受体植物基因组中，由于和它邻近的基因表达位置的不同，就可以得到标记了绿色荧光蛋白的表达 GAL4 基因的株系。2 植物 GAL4UAS 体系的建立1 拟南芥中 GAL4UAS 体系构建及应用 Haseloff 发现由于 GAL4 序列中存在高 AT 含量，这些序列会影响植物中 mRNA 的加工，使 GAL4 不能在拟南芥中表达。为了解决这一问题，他们用 VP16 代替 GAL4 中的第 7 页 共 13 页 激活部位，建立了一个高 AU 含量的 GAL4-VP16 体系，使得其在植物前mRNA 拼接过程中

18、起到很好的识别内含子的作用，从而在拟南芥中高效表达。GAL4-VP16 随机插入到拟南芥基因组中，其表达依赖于与它邻近的基因增强子序列。为了检测 GAL4-VP16 的表达，他们还将 mGFP5 基因融合到这段插入片段中，由于和它邻近的基因表达位置的不同，这样就得到标记了绿色荧光蛋白的表达 GAL4 基因的不同细胞。在这些细胞中，筛选收集到了 250 株只在拟南芥根尖不同细胞中稳定表达的GAL4 株系。后续研究者可以将感兴趣的目标基因融合到 UAS 编码框后，得到UAS-目标基因系，通过与这些 GAL4-VP16 系杂交，或者用 UAS-目标基因农杆菌，直接转化 GAL4-VP16 系，获得在

19、根尖不同细胞中稳定表达目的基因的子代，有利于更精确地研究目的基因的功能。除上述最初筛选到的 250 个株系外，其他研究者还从 Haseloff 等建立的 GAL4-VP16 株系中筛选到了新的组织特异性表达株系，如 Laplaze 等筛选得到 401 株在侧根不同发育阶段特异性表达的株系;Gardner 等筛选得到了 4 株在气孔保卫细胞特异表达的株系，并发现其中大部分只在气孔保卫细胞表达，且其表达特异性不受外界环境变化。这些制备并经过验证的细胞和组织特异表达的 GAL4-VP16 株系为研究植物信号传导及其作用机制提供了有效工具。赤霉素可以通过促进拟南芥根中细胞的有丝分裂来调节分生组织大小，

20、进而调控根细胞的伸长，维持根生长。为了确定 GA 是通过分生区中哪些细胞来控制根细胞的增殖，Ubeda-Tomas 等利用上述 Haseloff 等建立的在不同根组织中表达的 GAL4-VP16 株系，包括 J0571、Q2500、J0631 和 J234第 8 页 共 13 页 1，使突变基因 GAI 在这些组织中特异性表达，结果发现在柱干细胞和伸长区细胞中表达 GAI 后，分生组织大小与野生型一样;而在皮层或内皮层中表达 GAI 则导致分生组织明显变小，从而说明 GA 是通过促进内胚层中细胞的增殖来控制根分生组织的大小，控制根的生长。同样 Duan 等利用 Haseloff 等建立的株系研

21、究高盐胁迫对拟南芥幼苗侧根的抑制作用中的细胞特异性。他们在前期研究中发现 ABA 参与这一抑制作用。为了验证 ABA 的这一调控是否具有组织特异性，作者首先利用上述 Haseloff 等建立的在不同根细胞中表达的 GAL4UAS 株系，特异表达能引起 ABA 不敏感的突变基因 abi1-1,发现在这一调控中 ABA 信号传导主要在内皮层和皮层;然后他们进一步利用内皮层和皮层特异表达的启动子，锁定了内皮层为 ABA 信号传导的关键场所。Haseloff 等建立的组织特异性表达株系也被用来研究植物对环境因子的响应机理。如 Moller 等利用在拟南芥根中细胞特异性表达的GAL4UAS 株系研究钠离

22、子转运蛋白的组织特异性表达对植物抗盐性的影响。作者选用两种在根和中柱中稳定表达的 GAL4 株系，J2731 和E2586，使 HKT 基因在这些细胞中特异表达。发现在根中柱细胞中表达HKT1.1 会增强钠离子流入的能力，减少钠离子从根中到茎中的转移，并导致茎中钠离子浓度降低，使植物的抗盐能力增强。Plett 等用在表皮和皮质细胞层特异表达的 GAL4 株系发现在拟南芥根表皮和皮层特异表达 HKT1.1 会增加茎中钠离子的积累。2 水稻 GAL4UAS 体系构建及应用 Wu 等在水稻 中花 11 和 中花 15中建立了 GAL4-VP16UAS 体系，将经过修饰的 GUS 报告基因放在 6 U

23、AS第 9 页 共 13 页 启动子上，用来检测基因在不同位置的表达，得到了约 31443 株 F1 代有 GUS 标记的单株。通过用 GAL4VP16 编码区的引物进行 PCR 扩增和GAL4VP16 特异探针进行核酸杂交验证，大部分 F1 代 GAL4 株系都有 T-DNA 插入，其中约有一半为单拷贝插入。由于 GUS 标记需要经过组织化学染色、固定等步骤才能确定表达位置。Johnson 等以 GFP 为报告基因，得到具有不同表达强度的 GFP 转化株，在水稻中建立了一个可快速、跟踪检测的 GLA4UAS 系统。Plett 等利用 Johnson 等人建立的水稻GAL4-GFP 系统中在木

24、质和皮层有 GFP 特异表达的 AGF03 和 AOHB03 株系，将拟南芥 HKT1.1 基因在这些 GAL4 系中特异表达。发现当用盐胁迫处理时，与对照相比，水稻皮层中特异表达 HKT1.1 的转化株干重明显增加，根中钠离子增加，茎中钠离子浓度变低;而木质部中 HKT1.1 的特异表达转化株干重减轻，茎中钠离子浓度升高，而根中降低。这些结果与在拟南芥中得到的结果相同，说明钠离子在特定细胞中的转运与植物抗盐性间的关系在拟南芥和水稻中非常相似。可见组织特异性表达这一研究工具在粮食作物的重要农艺性状研究中具有广阔的应用前景。3 讨论与展望虽然现在已经分离得到了许多细胞或组织特异的启动子，但对于多

25、细胞和组织器官复杂的高等植物来说，还是远远不够的，而且启动子具有物种特异性，在不同物种中其驱动的基因表达位置可能存在差异。目前，由于转录组、蛋白质组和基因组测序技术的发展，给分离更多的特异性启动子提供大量数据，尤其是转录组数据的分析可以帮第 10 页 共 13 页 助我们更快的认识基因在时间和空间的表达模式，进而开发更多新的有用的特异性启动子，实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控，使其在可控条件下为基础研究和作物性状改良创造更多可能。由于 GAL4-UAS 系统在建立时 GAL4 基因是随机插入基因组的，这就使它存在不可避免的缺点：单一株系在多个不同细胞和组织中都有目的基因的表达;

26、这种多细胞表达的组合是随机的，强弱不同，不是研究想要的组合;得到的不同组织特异的 GAL4 群体可能不能完全包含研究所需要的全部细胞类型。因此，在研究特定基因的功能或信号响应和应答的特异组织定位时，不仅需要筛选分离和验证更多细胞或组织特异的启动子，建立和扩大组织特异的 GAL4UAS 群体，优化得到有规律或实验所需的细胞表达组合，还要将组织特异的启动子和 GAL4UAS 株系结合起来，利用各自特点先通过在多个不同细胞和组织中都有目的基因表达的 GAL4UAS 株系，将信号响应目标细胞定位到很小的区间，再通过已知的细胞特异的启动子驱动目的基因在其表达，最终将响应特定信号的细胞类型确定下来。目前文

27、献中报道和广泛使用的 GAL4UAS 系统大多是以果蝇、老鼠、斑马鱼、拟南芥和水稻等模式生物建立的，主要用于研究特定基因的功能或者信号响应的特异组织定位，或者在特定细胞或组织中表达致死的基因，达到切除靶细胞的作用。随着测序技术和遗传转化技术的进步，使得 GAL4UAS 技术日益成熟，我们有望在更多的动植物中建立这种细胞和组织特异表达的库，用于改良作物的产量和品质，疾病治疗等。第 11 页 共 13 页 附送：两篇关于两学一做学习讨论发言稿两篇关于两学一做学习讨论发言稿两学一做学习讨论发言稿（二）按照中央和省、市委要求，“两学一做”学习教育要开展四次专题讨论。5 月下旬，全区不少基层党组织在“送

28、党课”活动的领学、导学之后，开展了“讲政治、有信念、做对党忠诚的党员”专题讨论。讨论会上，一个个党员结合个人成长经历和实际情况，对照党章党规、先辈先进、职能职责，谈学习感受、谈思想认识、谈问题不足、谈整改方向，在交流中共同提高，在沟通中增进感情，做到了坦诚相见、肝胆相照、见人见事见思想。从组织人事局、经济发展局、统计局等机关支部，第五、第九、第十二等非公党建联组，白马、牌楼坝、真人桥等村报送的信息来看，第一次专题讨论具有三个特点。先学一步、深学一层的“自觉性”。即引导党员在集中学习前“自学预习”，在专题讨论时“厚积薄发”，在集中学习后“温习提升”。为此，区党工委为全区党员干部、党组织书记配备了

29、习总书记系列重要讲话读本、干部要干事、为官要有为、党章党规汇编等学习资料，部分党组织也为党员配发了学习资料，并引导党员撰写发言提纲或学习心得。为调动党员“两学一做”的自觉性，区党工委还印发了学习教育记录第 12 页 共 13 页 卡，用以记录每个党员参加集中学习的情况，作为党员民主评议的重要依据。知行合一、学用结合的“实践性”。很多党员都把专题讨论与中心工作、自身业务结合起来，谈意见建议，提努力方向，做到了学习教育与实际工作两手抓、两促进。例如，非公党建第五联组的党员表示，要注重践行，用自己的行动去影响身边更多的人;要带头做好，用行动证明党员就是“特殊材料”炼成的人;要勇于担当，用工作实践助推企业和谐发展。互相学习、取长补短的“开放性”。不仅党组织内部相互学习，有的还与其他单位党组织一起开展讨论，一起过组织生活。例如，5 月 28 日，非公党建第 12 联组与雷锋街道廖家坪村一起上微党课、一起座谈讨论、一起赛红歌，第组也计划在 6 月 4 日与金南村第二党小组一起学习讨论。在 5 月最后两天的“群众工作日”，一些管委会机关局室也与联点村、社区一起组织了专题讨论。麓谷街道环城绿带拆迁工作指挥部把指挥部设在金南村第五党小组，既自己学在一线、做在一线，又与党小组一起学习讨论。第 13 页 共 13 页