《生物化学与分子生物学》第二十三章DNA重组和重组DNA技术.ppt

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1、第23章 DNA重组和重组DNA技术是指不同DNA分子经过断裂和连接形成新DNA分子的过程 l DNA重组（DNA recombination） 两个基本概念基本概念：是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程 l 重组DNA技术（Technology of DNA recombination） 第一节 自然界的DNA重组和基因转移第二节 重组DNA技术第三节 重组DNA技术在医学中的应用重点难点熟悉了解掌握1.自然界DNA重组的基本方式2.重组DNA技术的基本流程3.载体的基本特点及分类1.重组DNA技术中最常用工具酶及其特点2.目的基因的获取方式3

2、.T-A克隆及蓝白筛选的基本含义1.自然界DNA重组不同方式的基本工作原理2.重组DNA技术在医学中的应用自然界的DNA重组和基因转移第一节Holliday同源重组依赖DNA分子间序列的相同或相似性输入标题（一）Holliday模型是最经典的同源重组模式四个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体（inter-mediate）通过分支移动（branch migration）产生异源双链（heteroduplex）DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA 一、同源重组一、同源重组是最基本的DN

3、A重组方式同源重组（homologous recombination）又称基本重组（general recombination）是指发生在两个DNA分子同源序列之间的互换过程 一、同源重组同源重组的Holliday模型Holliday中间体切开方式不同，所得到的重组产物也不同：片段重组体（右）（patch recombinant） 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA 拼接重组体（左）（splice recombinant） 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA 一、同源重组（二）RecBCD模式是大肠埃希菌的Holl

4、iday同源重组 RecBCD复合物 三种酶活性：核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶活性 RecA蛋白 可结合单链DNA（ssDNA） RuvC蛋白核酸内切酶活性能专一性识别Holliday连接点 例如：鼠伤寒沙门菌H抗原编码基因中H片段重组就是一种位点特异性重组二、位点特异性重组二、位点特异性重组是发生在特异位点间的DNA整合 位点特异性重组：由整合酶催化完成H片段PPhinhixhixH2rH1Hin倒转酶H2鞭毛蛋白H1阻遏蛋白倒转酶，是一种重组酶，负责H片段的倒转 图23-2.沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变H片段PPhinhixhixH2rH1Hin倒转酶H2鞭毛蛋白H1阻遏蛋白hixH2

5、rH1q重组位点靠近PPhinhixhixH2rH1H片段倒转位点之间H片段发生倒转H1H1H1鞭毛蛋白Hin倒转酶P（一）插入序列是最简单的转座元件三、转座重组三、转座重组可使基因位移转座重组：是指基因（或DNA序列）从一个位置移动到另一位置 这些可移动的DNA序列包括：插入序列（insertion sequence, IS）转座子（transposon, Tn） 结构特征：两端是反向重复序列（inverted repeat, IR）中间是一个转座酶（transposase）编码基因 TAGC转座酶基因TAGC正向重复序列正向重复序列4-12 bp正向重复序列正向重复序列4-12 bp反向重

6、组序列反向重组序列9-41 bp反向重组序列反向重组序列9-41 bp750 1500 bp三、转座重组（二）转座子可以在染色体间转座 转座子（transposon, Tn）与IS类似点：侧翼是反向重复序列，并有转座酶基因与IS不同点：含有抗生素抗性等基因 在很多Tn中，其侧翼序列本身就是IS 四、原核细胞的基因转移或重组四、原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组 接合作用（conjugation）：是质粒DNA通过细胞间相互接触发生转移的现象 转化作用（transformation）： 是受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象 转导作用（transduction）： 是病毒将供

7、体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象 以上三种方式是原核细胞基因转移或重组的方式，真核细胞自然情况下极少采用这些方式，五、CRISPR/Cas系统五、细菌可通过CRISPR/Cas系统从病毒获得 DNA片段作为获得性免疫机制CRISPR/Cas系统是噬菌体或质粒DNA与宿主菌基因组DNA之间发生整合的一种方式，并以此成为细菌防御病毒再次感染的获得性免疫机制 1CRISPR序列的结构特征 五、CRISPR/Cas系统2. 外源DNA可插入宿主基因组的CRISPR座位中 当噬菌体感染宿主菌时靶向性复合物与病毒DNA片段形成Cas1Cas2复合物Cas1Cas2复合物将病毒DNA片段插入宿主菌

8、基因组DNA的CRISPR座位的第一个位点插入的DNA片段两端是重复序列五、CRISPR/Cas系统3. CRISPR/Cas系统是细菌的获得性免疫机制 当噬菌体再次感染宿主菌时CRISPR座位转录产生pre-crRNAtracrRNA基因转录产生tracrRNAtracrRNA与pre-crRNA在cas9作用下形成引导RNA（gRNA）-cas9复合物gRNA-Cas9复合物靶向病毒DNA并将其切割消化第一节小结小结：自然界DNA重组方式主要包括：同源重组，Holliday模式是最经典的同源重组模式位点特异性重组转座重组或转座，包括插入序列和转座子的重组接合，通过细胞接触所发生的基因转移转

9、化，通过细胞自主摄取发生的DNA整合转导，病毒感染介导的DNA整合CRISPR/Cas9系统，细菌获得病毒DNA用于攻击病毒重组DNA技术第二节序言：又称：分子克隆（molecular cloning）DNA克隆（DNA cloning）基因工程（genetic engineering）主要过程：在体外将目的DNA与能自主复制的遗传元件（载体）连接，形成重组DNA分子重组DNA分子在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一DNA分子的大量拷贝 重组DNA技术一、工具酶一、重组DNA技术中常用的工具酶常用工具酶主要包括：限制性核酸内切酶（RE）DNA连接酶DNA聚合酶逆转录酶碱性磷酸酶其中RE

10、和DNA连接酶是最常用的工具酶一、工具酶 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease, RE） 三种类型：I型、II型、III型特点：I型和III型酶为复合功能酶，同时具有限制和DNA修饰两种作用，且不在所识别的位点切割DNA（即特异性不强）II型酶能在DNA双链内部的特异位点识别并切割，故其被广泛用作“分子剪刀”，对DNA进行精确切割 一、工具酶 识别位点通常为6或4个碱基序列，个别的RE识别8或8个以上碱基序列 大多数RE的识别序列为回文结构（palindrome） 有些RE所识别的序列虽然不完全相同，但切割DNA双链后可产生相同的黏端，这样的酶彼此互称同尾酶（is

11、ocaudamer） 有些RE虽然来源不同，但能识别同一序列（切割位点可相同或不同），这样的两种酶成同裂酶（isoschizomer） II型RE的特点：二、载体二、重组DNA技术中常用的载体载体（vector）是为携带目的外源DNA片段、实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子 按其功能可分为两类：克隆载体（cloning vector）表达载体（expression vector） 二、载体（一）克隆载体用于扩增克隆化DNA分子克隆载体是指用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的DNA分子。克隆载体的基本特点：至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，

12、并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；至少有一个选择标志（selection marker），从而区分含有载体和不含有载体的细胞，如抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等；有适宜的RE单一切点，可供外源基因插入载体。 二、载体质粒克隆载体是重组DNA技术中最常用的载体 质粒：是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子，具备作为克隆载体的基本特点 例如：pUC18质粒载体二、载体表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体依据其宿主细胞的不同可分为：原核表达载体（prokaryotic expression vector）真核表达载体（eukaryo

13、tic expression vector）二者的区别主要在于为外源基因提供的表达元件。（二）表达载体能为外源基因提供表达元件二、载体原核表达载体 用于在原核细胞中表达外源基因除了具有克隆载体的基本特征外，还有供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列，如启动子、核糖体结合位点即SD序列（Shine-Dalgarno sequence）、转录终止序列等 二、载体真核表达载体 除了具备克隆载体的基本特征外，所提供给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。质粒真核表达载体的特点：含有必不可少的原核序列，如复制起点、抗性基因、MCS等真核表达调控元件，如真核启动子、增强子、转录终止序列、poly A加尾

14、信号等真核细胞复制起始序列真核细胞药物抗性基因三、原理及步骤三、重组DNA技术的基本原理和操作步骤一个完整的DNA克隆过程五大步骤：目的DNA的分离获取（分）载体的选择与准备（选）目的DNA与载体的连接（连）重组DNA转入受体细胞（转）重组体的筛选及鉴定（筛）三、原理及步骤分离获取目的DNA的方法主要有以下几种：化学合成法从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA PCR法其他，如酵母双杂交系统克隆DNA结合蛋白基因目前最常用的方法是PCR法（一）目的DNA的分离获取是DNA克隆的第一步三、原理及步骤DNA克隆的目的主要有二：一是获取目的DNA片段二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质针对

15、第一种目的，通常选用克隆载体针对第二种目的，需选择表达载体 另外，选择载体时还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素例如：质粒载体一般能容纳5-10kb以内 黏粒可容纳50 kb（二）载体的选择与准备是根据目的DNA片段决定的三、原理及步骤依据目的DNA和线性化载体末端的特点连接策略如下：黏端连接：单酶相同黏端的连接 不同黏端的连接 通过加尾产生黏端的连接平端连接黏-平端连接 黏端、黏-平端连接，具有方向性 平端连接，没有方向性+（三）目的DNA与载体连接形成重组DNA三、原理及步骤将重组DNA导入宿主细胞常用方法有如下： 转化：是指将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程，受体细胞经

16、过处理成为感受态细胞（competent cells）转染：是指将外源DNA直接导入真核细胞（酵母除外）的过程，常用磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法 感染：是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导入宿主细胞的过程，如噬菌体、腺病毒等 （四）重组DNA转入受体细胞使其在体内得以扩增三、原理及步骤重组DNA分子导入宿主细胞后，可通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定，从而获得含重组DNA分子的宿主细胞 筛选和鉴定方法主要有： 1. 遗传标志筛选法抗生素抗性筛选插入失活/插入表达筛选利用标志补救筛选利用噬菌体的包装特性筛选2. 序列特异性筛选，如核酸杂交法，DNA测序法3. 亲和筛选

17、法（五）重组体的筛选与鉴定三、原理及步骤举例： 插入失活筛选tetR基因失活筛选三、原理及步骤 利用标志补救筛选互补筛选三、原理及步骤 核酸杂交法筛选属于序列特异性筛选三、原理及步骤克隆基因的表达涉及表达体系的选择及应用表达体系可笼统地分为：原核表达体系E.coli是当前应用最多的原核表达体系真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳细胞等（六）克隆基因的表达三、原理及步骤原核表达载体的必备条件运用E.coli表达蛋白质的表达载体应符合下述标准：含大肠杆菌适宜的选择标志具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子含适当的翻译控制序列含有合理设计的MCS1. 原核表达体系如：pET系列表达载体pET28a质粒

18、oriLac IKanRP T7OLacMCSTTSD乳糖操纵子结构pET-28a(+)(5369bp)三、原理及步骤E.coli表达体系的缺点诸如：缺乏转录后加工机制因此，对于真核基因来说，E.coli表达体系只能表达经逆转录合成的cDNA编码产物缺乏适当的翻译后加工机制因此，真核基因的表达产物在E.coli表达体系中往往不能被正确的折叠或糖基化修饰外源基因表达的蛋白质易形成不溶性包含体很难用E.coli表达体系表达大量的可溶性蛋白质 因此，对于很多真核基因的表达需要采用真核表达体系三、原理及步骤2. 真核表达体系 Poly (A)n加尾信号在真核细胞中表达的抗性基因启动子在原核细胞中表达的

19、抗性基因ori细菌质粒的细菌质粒的一部分一部分从而使真核表达质粒能在原核细胞中复制。PCMVMCSpRc/CMV5.5kb真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly A加尾信号或染色体整合位点等。 例如：真核质粒载体pRC/CMV质粒三、原理及步骤真核表达体系的优势：具有转录后加工机制转录后mRNA的剪接、加poly A尾等具有翻译后修饰机制蛋白质的糖基化修饰、乙酰化修饰等表达的蛋白质一般不形成包含体但酵母表达的蛋白质有时也形成包含体表达的蛋白一般不易被降解当然，操作技术难、费时、费钱是其缺点。第二节小结小结：重组DNA技术主要涉及：五个基本步骤

20、：分、选、连、转、筛工具酶中最重要的是限制性核酸内切酶（简称RE）载体最基本的特点是自主复制能力、单一酶切位点及筛选标志表达克隆基因时需根据宿主细胞选择正确的载体表达载体是在克隆载体的基础上加上基因表达调控元件目的基因与载体的连接策略中效率最高的是黏性末端连接重组体的筛选最常用的是抗性筛选，最有特色的是蓝白筛选重组DNA技术在医学中的应用第三节一、用于生物制药重组DNA技术：已广泛应用于生命科学和医学研究、疾病诊断与防治、法医学鉴定、物种的修饰与改造等诸多领域，对医学临床及医学研究的影响日益增大。 一、重组DNA技术用于生物制药例如重组人胰岛素、干扰素等重组HBV、HPV VLP疫苗人源化单克

21、隆抗体，如赫赛汀Ab的的Fab片段片段二硫键二硫键噬菌体呈现筛选噬菌体呈现筛选确定编码基因确定编码基因全套抗体的全套抗体的H链和链和L链链的基因文库的基因文库二、医学研究技术平台二、重组DNA技术是医学研究的重要技术平台例如，人类疾病动物模型 如：癌症，糖尿病，老化症等 遗传修饰猪从猪到人的器官移植遗传修饰细胞模型 如：疾病的替代治疗/靶向治疗Car T 体内示踪GFP发光示踪发现基因新功能或新基因遗传修饰猪人源化猪肾脏从猪到人的肾脏移植三、基因及其表达产物研究的技术基础三、重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础1. 在基因组水平上干预基因 传统的基因敲除条件性基因打靶基因组编辑2.在

22、RNA水平上干预基因的功能 RNA干涉3. 研究蛋白质的相互作用酵母双杂交系统质粒载体pU6pCMVCas9Cas9基因组编辑自然界DNA重组的方式有多种：同源重组，位点特异性重组，转座重组原核细胞还有：接合、转化、转导 CRISPR/Cas系统的基因整合重组DNA技术主要步骤：目的DNA的分离获取（分）载体的选择和准备（选）目的DNA与载体的连接（连）重组DNA转入受体细胞（转）周日细胞的克隆化及筛选鉴定（筛）重组DNA技术的实施涉及相关的理论基础诸如：基因结构基因表达单位基因表达调控元件，等本章知识点框架图：DNA重组和重组DNA技术自然界DNA重组和基因转移重组DNA技术同源重组工具酶Holliday模型位点特异性重组1. 限制性核酸内切酶（RE）2. DNA连接酶载体1. 克隆载体，如：质粒克隆载体2. 表达载体：原核表达载体 真核表达载体操作基本步骤重组DNA技术在医学中的应用转座重组1. 插入序列2. 转座子基因转移1. 接合2. 转化3. 转导CRISPR/Cas系统克隆基因表达1. 原核表达载体必备条件2. 真核表达系统的优势用于生物制药1. 重组人胰岛素2. 重组人干扰素3. 重组HBV疫苗，等医学研究平台1. 遗传修饰动物模型2. 遗传修饰细胞模型，等基因及其表达产物研究的技术基础1. 干扰基因功能2. 干扰RNA3. 蛋白质相互作用