《生物化学与分子生物学》第十二章DNA合成.ppt

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1、第十二章 DNA合成第一节 DNA复制的基本规律第二节 DNA复制的酶学和拓扑学第三节 原核生物DNA复制过程第四节 真核生物DNA复制过程第五节 逆转录重点难点熟悉了解掌握掌握DNA复制体系的组成、半保留复制的特点及其意义；掌握DNA复制的基本规律， DNA聚合酶的类型及功能特点DNA复制的过程，原核DNA复制与真核DNA复制的主要区别；真核生物DNA端粒及端粒酶非染色体DNA复制的其他形式；了解逆转录的发现发展了中心法则DNA复制的基本规律The basic law of DNA replication第一节 DNA复制的主要特征: 半保留复制(semi-conservative repl

2、ication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链一、DNA以半保留方式进行复制 半保留复制的概念: 子链继承母链遗传信息的几种可能方式: 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 密度梯度实验:含含15N-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息

3、，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的 半保留复制的意义: TCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGAGGTACTGTCCATGACAGGTACTGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGG+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA二、DNA复制从起始点双向进行 原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点

4、起始双向复制复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A. 环状双链DNA及复制起始点B. 复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C 真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子（replicon）。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制3三、DNA复制以半不连续方式进行3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3

5、 3 5 领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand) 沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的，这股链称为前导链（leading strand） 另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从53生成引物并复制子链。模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合成另一段子链，这一不连续复制的链称为后随链（lagging strand） 沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazaki fragment）四、DNA复制具有高保真性 “半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的

6、绝对保真性 高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一；体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性；DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统对错配加以纠正DNA复制的酶学和拓扑学Enzymology and topology of DNA replication第二节 参与DNA复制的物质: 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol 模板(template): 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依

7、次聚合 其他的酶和蛋白质因子(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 活性： 1. 53的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性: 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 ? 35外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解 53外切酶活性: 能切除突变的 DNA片段（一）原核生物有3种D

8、NA聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 分子量（kD）109120250组成单肽链？多亚基不对称二聚体分子数/细胞400？2053核酸外切酶活性有无无基因突变后的致死性可能不可能可能原核生物的DNA聚合酶个核心酶1个 -复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚基）1对 -亚基（可滑动的DNA夹子）全酶结构包括： DNA聚合酶全酶结构: 亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35 外切酶活性（复制保真性所必需） 亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用核心酶由 、 和 亚基组成：两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板

9、滑动的作用2个 -亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用 -复合物由6种亚基组成： 、 、 、 、 、 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补功能： DNA-pol （109kD）:323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室

10、合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶分子生物学研究中常用的工具酶 DNA-pol （120kD）: DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复（一）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种 DNA-pol 起始引发，有引物酶活性 DNA-pol 参与低保真度的复制 DNA-pol 在线粒体DNA复制中起催化作用 DNA-pol 合成后随链 DNA-pol 合成前导链E.Coli真核细胞 功能填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组复制中

11、的校对，DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成DnaG 引物酶 后随链合成真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较 DNA-pol 分子量（kD）16.54.014.012.525.553聚合活性中？高高高35核酸外切酶活性-+功能起始引发，引物酶活性低保真度的复制线粒体DNA复制合成后随链合成前导链真核生物的DNA聚合酶二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:遵守严格的碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能复制出错时有即时校对功能（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择 利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporat

12、ion）具有选择功能 DNA pol 对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能 （二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性DNA pol 的校读功能三、复制中DNA 分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。 蛋白质（基因）通用名功能DnaA（dnaA） 辨认复制起始点DnaB（dnaB）解旋酶解开

13、DNA双链DnaC（dnaC） 运送和协同DnaBDnaG（dnaG）引发酶催化RNA引物生成SSB单链结合蛋白/DNA结合蛋白稳定已解开的单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶又称促旋酶解开超螺旋原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态 解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整解链过程中正超螺旋的形成复制过程

14、正超螺旋的形成：ABCDNA只固定一端DNA两端固定解开10个碱基对（一个螺旋）DNA将会旋转一圈DNA形成一个超螺旋解开10个碱基对（一个螺旋）蛋白分子DNA负超螺旋开口易化正超螺旋开口受阻拓扑异构酶作用特点:既能水解 、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类及作用机制： 拓扑异构酶：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP 拓扑异构酶：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态拓扑酶的作用方式：四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口连接DNA链3 -OH末端和相邻DN

15、A链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：DNA连接酶的作用：功能:DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用也是基因工程的重要工具酶之一DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较 提供核糖提供核糖3 3 -OH-OH提供提供5 5 -P-P结果结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态原核生物DNA复制过程DNA replication in p

16、rokaryotes第三节起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板2. 形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端一、复制的起始原核生物的复制起始部位及解链原核生物的复制起始部位及解链 （此图有误需修改）（此图错误部分包括文字和少了一个9bp重复序列已在图中标注，请编辑帮忙修改） Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和起始复合物形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为起始复合

17、物起始复合物和复制叉的生成3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子引物引物3 HO5引物引物酶酶二、DNA链的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着5 3 方向可以连续地延长后随链的合成 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合oriter E.coli82

18、32 ori terSV40500三、复制的终止5 5 5 DNA-pol OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶子链中的RNA引物被取代真核生物DNA复制过程Eukaryotic DNA replication process第四节真核生物与原核生物DNA复制的差异：真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等 哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶

19、活性有关 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动 复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）、pol 和pol 参与。还需解螺旋酶活性、拓扑酶和复制因子(replication factor, RF) 一、真核生物复制的起始与原核基本相似酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色体含有多个复制起点。 元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC) 3个序列(B1、

20、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同酵母复制起始点拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋Tol和TolDNA双螺旋解链，参与组装引发体DNA解旋酶连接冈崎片段DNA连接酶核酸酶，切除RNA引物RNAse H核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol / 合成RNA-DNA引物Pol /引发酶有依赖DNA的ATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶， 促使PCNA结合于引物-模板链RFC激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，

21、使解旋酶容易结合DNARPA功 能蛋白质真核DNA复制叉主要蛋白质的功能 现在认为pol 主要催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol 和DNA pol 所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol 负责合成后随链，DNA pol 负责合成前导链。二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换 前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生DNA聚合酶转换的原因是Pol 不具备持续合成能力 DNA聚合酶转换的关键蛋白是RFCDNA聚合酶 / 转换真核DNA聚合酶转换和后随链合成3 5 5 3 前导链前导链3 5 3 5 亲代亲代DNA后随链后随链引物引物核小体核

22、小体三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体染色体DNA呈线状，复制在末端停止复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题切除引物的两种机制线性DNA复制一次端粒缩短 5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成 人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比5 端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题组成：端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶

23、协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶(telomerase) 端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3端。这些新合成的DNA为单链端粒酶催化作用的爬行和端粒的延长过程 真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能

24、复制一次前复制复合物在G1期形成而在S期被激活真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7前复制复合物（pre-RC）的形成pre-RC的激活的激活和组装真核和组装真核DNA复制叉复制叉 激活pre-RC，以起始DNA复制 抑制形成新的pre-RCCDK控制pre-RC的形成和激活真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的

25、蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活Cdk功能：D-环复制（D-loop replication）是线粒体DNA的复制形式六、真核生物线粒体DNA按D环方式复制dNTPDNA-pol 逆转录reverse transcription第五节逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录(reverse transcription) 逆转录酶一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链

26、双链DNARNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。 在 某 些 情 况 下 ， 前 病 毒 基 因 组 通 过 基 因 重 组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因 逆转录酶催化的cDNA合成分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链 n试管内合成cDNA:cDNA comp

27、lementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论 二、逆转录的发现发展了中心法则1、DNA复制的基本特点2、原核生物的复制过程包括起始、延长和终止（1）起始是将DNA双链解开形成复制叉（2）复制的延长由引物或延长中的子链提供3-OH，供dNTP掺入生成磷酸二酯键，延长中的子链有前导链和后随链之分，复制产生的不连续片段称

28、为冈崎片段（3）复制的终止需要去除RNA引物、填补留下的空隙并连接片段之间的缺口使成为连续的子链3、真核生物复制发生于细胞周期的S期，其过程与原核生物相似，但更为复杂和精致。复制的延长和核小体组蛋白的分离和重新组装有关。复制的终止需要端粒酶延伸端粒DNA4、非染色体基因组采用特殊的方式进行复制本章知识点框架图：DNA复制原核生物复制真核生物复制起始：DNA的解链；引物合成和引发体形成延长：复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 终止：双向复制的复制片段在终止点处汇合起始：与原核生物基本相似延长：DNA聚合酶转换；核小体组蛋白的分离和重新组装终止：需要端粒酶延伸端粒DNA