2022年CRISPR操作系统原理.pdf

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1、CRISPR操作系统原理一图瞧破 CRISPR 操作系统！近日,Cell 发表了一篇名为 “SnapShot: CRISPR -RNA-Guided Adaptive Immune Systems ”的精华文章 ,用一张图 ,就全解析了 CRISPR 系统的“ 中心法则” 。 今天就让麦子带大家分解此图,真正掌握时下这个可以对人、 老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫与农作物等细胞内的基因进行精确编辑的热门技术之精髓:细菌与古细菌已经根据CRISPR( 规律成簇的间隔短回文重复,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)

2、位点与多样化 CRISPR 相关(CRISPR-associated,Cas)基因,进化出了复杂的 CRISPR 适应性免疫系统 。CRISPR 系统可以分为三种类型 (I-III)及至少 11 种不同的亚型(I-AI-F,II-AII-C,III-AIII-B)。 但就是所有的 CRISPR-Cas 免疫系统都就是通过主要的三个阶段来行使功能: ?外来 DNA 的采集?CRISPR RNA 的生物合成?靶向干扰第一阶段 :外来 DNA 的采集 (Foreign DNA Acquisition)精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 -

3、- - - - - - - - -第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - - CRISPR操作系统原理宿主通过 Cas 蛋白来识别外源核苷酸 ,入侵细菌的短片段 DNA 称为 protospacers,它们作为间隔区序列插入到了宿主的CRISPR 位点。在 I 与 II 型系统中,protospacers 选择自入侵 DNA 旁出现 PAM 的区域 (PAM:protospacer adjacent motif, 对于 CRISPR 结合至关重要 )。 一般 protospacers 通过包含 Cas1、Cas2 与游离 3-羟基等元件的机制连接在CRISPR 位点的前导区

4、 (Leader) 。Protospacer 的整合也伴随着末端重新序列复制,这可能涉及宿主聚合酶与DNA修复机制。第二阶段 :CRISPR RNA 的生物合成 (crRNA Biogenesis)精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - - CRISPR操作系统原理CRISPRRNA 的生物合成从转录开始 ,接下来就是初级转录产物pre-crRNA 加工生成一类短的 CRISPR 衍生 RNAs(crRNAs), 每一个都包含与之前遇到的外源

5、DNA(Spacer 序列)对应的互补序列。 crRNA 导向序列的两侧就是相邻重复序列区域。在 I 型与 III 型系统中 ,初始 CRISPR 转录产物会被 CRISPR 特异性核酸内切酶(Cas6 或 Cas5d) 在重复序列位点内切割。 在许多 I 型系统中 ,重复序列就是回文结构的 ,Cas6 可以稳定连接在 crRNA 3 端茎环上。而在III 型系统中 ,Cas6短暂与 CRISPRRNA 连接,crRNA 的 3端会被未知的核酸酶进一步处理。CRISPRRNA 的加工在 II 型系统中依赖于包含一个与重复序列互补序列的反式作用 crRNA (tracrRNA) 。 这些双链的区

6、域在Cas9 存在时可以被 RNaseIII 加工,靶向干扰需要 tracrRNA 与 crRNA 的同时存在。 II 型系统中的这两个RNAs 可以融合成一个 sgRNA, 目前,II 型系统就是我们研究的 “ 火力” 较为集中的系统 ,而Cas9 已经变成了在多种细胞类型与组织中靶向基因编辑的强大工具。第三阶段 :靶向干扰 (Target Interference)成熟的 crRNAs 指导 Cas 蛋白到互补靶标 ,靶序列由特异性的 Cas 核酸酶降解 ,但不同的 CRISPR 系统降解机制存在差异 :I 型与 II 型系统都可以靶向包含PAM与 protospacer 互补序列的 ds

7、DNA 底物。在 II 型系统中 ,靶标的降解就是通过单精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - - CRISPR操作系统原理一的蛋白 Cas9 与两个 RNAs 来实现的 ,而在 I 型系统中 ,则依赖于包含多个亚型的复合物 ,可以结合 dsDNA 并招募 Cas3,Cas3 就是一个反式作用的核酸酶,经常融合到依赖于 ATP 的解旋酶上。类似于I 型系统 ,III 型系统也同样依赖于探测目标的多亚基复合物 ,这些复合物展示出了内源性核酸酶活

8、性,依赖于转录方式降解互补的 RNA、靶向 DNA,不过 III 型系统不依赖于 PAM 进行靶标位点的识别 ,而就是通过碱基互补配对 ,导向序列延伸至 crRNA 信号 5handle 的核苷酸进行识别(CRISPR 位点包含与导向序列 ,5handle 互补的序列 ),并阻止靶向裂解。关闭颈环在 I 型系统中 ,复合物靶向结合会导致Cas3 介导的靶向降解 (直接干扰 )或最初采集,这其中涉及 crRNA 导向募集 Cas3、 Cas1 与 Cas2 到外源 DNA 处,引起新一轮的快速采集。 II 型系统中虽然未观察到最初采集,但 Cas9 就是 protospacer 正确筛选的必要元

9、件 ,这表明在靶向干扰与外源DNA 采集之间存在一种功能性联系。 近期,多种可以产生 anti-CRISPRs 蛋白的病毒编码基因已经证明了可以干扰CRISPR 的不同阶段 ,这将颠覆 CRISPRs 系统。衍生阅读 :anti-CRISPRs精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - - CRISPR操作系统原理在 9 月的 Nature 文章: “Multiplemechanisms for CRISPRCas inhibition by a

10、nti-CRISPRproteins”中,研究人员确定了三种anti-CRISPR 蛋白:AcrF1 、AcrF2与 AcrF3 的功能机制 ,验证了它们通过不同的机制抑制CRISPR Cas 的活性。AcrF1 、 AcrF2 可以通过与不同的蛋白质亚基互作,利用了空间或非空间抑制模式来阻断了 CRISPR Cas 复合物的 DNA 结合活性 ,AcrF3 通过结合 Cas3 解螺旋酶-核酸酶 ,阻止其招募到结合DNA 的 CRISPR Cas 复合物上来起作用。 这就是首次证实了蛋白质相互作用可以调控CRISPR Cas 的活性。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - - -