2022年PCR实验室.pdf

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1、PCR实验室 (相关资料 ) PCR: 即聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction),利用 DNA在体外 95时解旋 (变性),55 时引物与单链按碱基互补配对的原则结合( 退火), 再调温度至 72左右 ,DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖 (5-3)的方向合成互补链 ( 延伸) 。PCR 仪实际就就是一个 温控设备 , 能在 95,55 ,72 之间很好地进行温度控制。根据 DNA 扩增的目的与检测的标准可以将PCR 仪分为 : 普通 PCR 仪, 梯度 PCR 仪, 原位 PCR 仪,实时荧光定量 PCR仪等几类。普通 PCR仪: 一般把一次PCR 扩增只能运行一个

2、特定退火温度的PCR 仪,称之为普通PCR 仪,也就就是传统的PCR 仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。普通 PCR 仪主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。如:启步 BSW-2P,BSW-3P,ABI 2720型梯度 PCR仪: PCR 反应能否成功 ,退火温度就是关键,梯度 PCR 仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置,根据结果 ,一步就可以摸索出最适反应条件。一次性 PCR 扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12 种温度梯度 )的称之为梯度PCR 仪。不同的 DNA 片段其最适合的退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR 扩增

3、就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。梯度 PCR 仪主要用于研究未知DNA 退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约成本。 在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR 用。梯度 PCR 仪多应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域以聚合酶链式反应(Picymerase Chain Reaction , PCR)为特征的、 以检测 DNA/RNA 为目的的各种病原体检测及基因分析。如:启步 BSW-2T,BSW-3T,ABI 9700,ABI Veriti, Bio-Rad T1

4、00型原位 PCR仪: PCR 就是提取细胞或组织中的DNA 进行基因扩增反应,而原位 PCR 就是保持细胞或组织的完整性,使 PCR 反应体系渗透到组织与细胞中,在细胞的靶DNA 所在的位置上进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA, 而且还可以了解靶DNA 存在于何种细胞中,更有利于探讨靶DNA 与细胞之间的关系。原位 PCR 仪主要应用于 :(1)检测外源性基因片段,提高检出率 ,集中在病毒感染的检查上,如 HIV、HPV 、HBV 、CMV 等;(2) 观察病原体在体内分布规律;(3)内源性基因片段,如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、 Ig 的 mRNA 片段、癌基因片段等 ;(4

5、) 检测导入基因;(5)遗传病基因检测如地中海贫血。实时荧光定量 PCR 仪: 在普通 PCR 仪设计基础上增加荧光信号采集系统与计算机分析处理系统,形成了具有荧光定量功能的 PCR 仪器。其 PCR 扩增原理与普通PCR 扩增原理相同,在 PCR 扩增时加入的引物就是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物与荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统,得出量化的实时结果输出。荧光定量 PCR 仪有单通道 ,双通道与多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道 ;有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记与目

6、的基因表达产物,因为一次只能检测精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 1 页，共 7 页 - - - - - - - - - - PCR实验室 (相关资料 ) 一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR, 实现一次检测多种目的基因的功能。荧光定量 PCR 仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。荧光定量检测技术在临床诊断方面很多,主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断,如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。通道

7、:channel 指的就是针对每一种荧光的检测器,比如您在一个管中做多个颜色,针对多个靶基因。每个颜色需要一个检测器来检测荧光信号的强弱,每一个针对不同颜色的检测器,就就是一个通道。在使用有些厂家 5 通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的精确性与准确性都要在实验中使用ROX( 一种荧光染料,ROX 就是作为内参的,即参照与校正实验结果。在 ABI 的机器里显示为红色的水平线。如果您的扩增线在刚开始的时候就高于ROX 证明有基因组DNA 污染。 )或专用的Reference dye ,这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来 ,真正能检测多重PCR 荧光信号的有效通道只有4 个,而且使

8、用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR 的检测通道就是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的 ,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。选择单通道实验还就是多通道实验？这就是要根据实验需要来选择的,如果有一个、两个或就是三个基因要进行比较,并用瞧家基因进行对照 ,可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处就是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多 ,一就是条件的优化比较麻烦,即多种 PCR 反应以及探针要在同一个反应条件下进行,并且效率都要比较高 ,另一个困难就是要求相互之间没有干扰,因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难就是当一个基因的模板数显著大于其她基因时,因

9、为共用核苷酸等资源的原因,会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些,即一个基因进行多样本比较,用瞧家基因进行对照。硬件设计 :传统的 96 孔板的荧光定量PCR 可以容纳的样本量大,而且无需特殊的耗材。有些传统的96孔板的仪器采用卤钨灯激发、CCD 检测 ,这些光学结构在96 孔板的顶部 ,每个样品孔距光源与检测器的光程各不相同边缘效应,对结果产生影响。为了保证精确、准确的实验结果,这类仪器在实验过程中通常会使用ROX( 一种荧光染料 )或专用的Reference dye作为参照校正实验结果。卤钨灯的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验过程中卤

10、钨灯作为一种热光源,产生较多热能对实验结果有一定的影响。CCD 最大的优点就就是可以同时扫描所有样品中的荧光信号,但就是灵敏度较低,而且同时检测样品间的荧光信号存在干扰。像ABI、Bio-rad 公司生产的荧光定量PCR 就属于这一种。创新的离心式的仪器通常选用LED 激发、 PMT 检测 ,离心式的设计上避免了边缘效应。LED 光源就是冷光源对实验没有影响,因此无需采用其她荧光染料校正仪器,而且使用寿命长无需经常更换。PMT 每次只能收集单个荧光信号,但就是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快,但也存在样本量小、耗材昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺点。Corbett 的 Rotor-g

11、ene系列与 Roche 的 Lightcycler系列均为这一类仪器。在荧光定量PCR 仪的众多技术参数中,升降温速度也就是厂家喜欢大力宣传的指标。更快的升降温,可以缩短反应进行的时间,而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间,提高 PCR 的特异性。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 7 页 - - - - - - - - - - PCR实验室 (相关资料 ) PCR 实验室内部分区图图 1 试剂储存区图 2 标本制备区图 3 扩增区图 4 产物分析区一、PCR 实验室布局 P

12、CR实验室原则上为试剂准备区、样品制备区、扩增区与扩增产物分析区四个单独的工作区域并设有专用走廊, 各工作区域应设缓冲间, 工作区与缓冲间宜安装连锁装置。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 7 页 - - - - - - - - - - PCR实验室 (相关资料 ) 不同功能的工作区应就是分隔独立的, 各工作区有明显的标志, 不能直通 , 如果紧密相连, 需安装物品传递窗。前两区为扩增前区, 后两区为扩增后区, 扩增前区与扩增后区应严格分开。实验材料、试剂、记录纸、笔、清洁材料等,

13、 只能从扩增前区流向扩增后区, 即从试剂准备区样品制备区扩增区扩增产物分析区,不得逆向流动。 实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区,不得逆向流动。各工作区顶部应安装紫外灯, 紫外灯的波长为254nm,每 20 一支 40W的紫外灯。二、PCR 实验室各区功能及主要设备1、试剂准备区 : 主要进行试剂的制备、分装与主反应混合液的制备。试剂与用于样品制作的材料应直接运送至该区, 不得经过其它区域。试剂原材料必须贮存在本区内, 并在本区内制备成所需的试剂。本区主要设备有天平、冰箱、离心机、加样器、振荡器等。对于气流压力的控制, 本区并没有严格的要求。2、样品制备区 : 主要进行样品的保存、核酸(R

14、NA 、 DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管与测定 DNA的合成。本区主要设备有冰箱、生物安全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴等。本区的压力梯度要求为: 相对于邻近区域为正压, 以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。3、扩增区 : 主要进行 DNA扩增。此外 ,已制备的 DNA模板 ( 来自样品制备区)的加入与主反应混合液( 来自试剂准备区) 制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区主要设备有: 扩增仪、冰箱、离心机、加样器等。本区的压力梯度要求为: 相对于邻近区域为负压, 以避免气溶胶从本区漏出。4、扩增产物分析区: 扩增产物的测定。本区主要设备有酶标仪、洗板机、加样器与水浴箱等。本区

15、的压力梯度的要求为: 相对于邻近区域为负压, 以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。三、PCR 实验室通风系统及压力控制各区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流, 形成单向流程的保护屏障, 避免实验之间的相互干扰, 防止气溶胶扩散对实验过程造成污染。 PCR实验室并没有严格的净化要求,但就是为避免各个实验区域交叉污染的可能性, 宜采用全送全排的气流组织形式, 严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。四、PCR 实验室装饰实验室围护结构应牢固、气密性好;所有阴阳角宜采用圆弧过渡; 墙体内壁光洁、不积尘、耐腐蚀、易清洗消毒; 地面使用 PVC卷材或环氧树脂自流坪, 材料应满足无缝隙

16、、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。五、PCR 实验室注意事项精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 7 页 - - - - - - - - - - PCR实验室 (相关资料 ) 1、几个区域的大小设置情况, 试剂准备区、扩增区、扩增产物分析区, 空间可以相对小一些, 样品制备区要放置生物安全柜与低温冰箱, 空间应大一些。2、试剂准备区、样品制备区设紧急洗眼器, 以保证操作人员的安全。3、PCR实验室没有严格的净化要求, 可以根据用户的使用情况与资金的投入选择。病理科病理诊断试剂及配套设备全

17、系列的产品, 涵盖了液基细胞学、免疫组织化学与分子基因诊断。产品包括液基细胞学系列产品、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR技术、一代测序技术、液相基因芯片技术等先进技术相关的仪器、试剂与耗材。沉降式全自动制片染色系统: 根据人体不同类型细胞其比重不同的特点, 尤其就是病变细胞比重大、沉降速度快 , 与特殊处理后的载玻片相互吸引, 从而最大程度地捕捉病变细胞与具有诊断价值的成分,自动湿染色 , 最终制成背景清晰、诊断线索明确的单层细胞薄片。全自动沉降式制片染色系统每批次可以处理 1-24 个标本 , 每天 7 小时可以处理300张制片 , 单片独立滴染, 染液一次性使用, 避免样本交叉污染。沉降式

18、全自动液基细胞学制片染色系统广泛应用于宫颈癌筛查, 同时诊断痰细胞、 尿液细胞、浆膜腔细胞、针吸细胞与内窥镜细胞。荧光原位杂交 (FISH): FISH 就是在细胞水平上检测染色体数目与基因数目及结构异常的分子生物学技术,其基本原理就是用荧光标记的核酸探针,经过变性退火 ,与样本中碱基互补序列特异性结合成DNA 双链 ,然后通过荧光显微镜检测分析。由于FISH 技术具有直观、快速、敏感性高与方便灵活的特性,已经广泛应用于肿瘤遗传学、基因相关疾病的分型与肿瘤个体化治疗等领域。液相芯片技术就是以100 种不同荧光编码的微球作为探针的载体,生物分子间的反应在悬浮液态体系中进行的一类新的生物芯片技术。

19、在这个灵活与开放的平台中可进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测、液相芯片较传统的固相芯片的优势在于检测准确、信息质量稳定、 可重复性好。 液相芯片以其易于操作、高通量、高灵敏度、高准确度、高精密度以及宽的线性测定范围的特点,逐渐进入了临床诊断领域。液相基因芯片 :将预先人工合成的寡核苷酸探针共价连接于微球表面构成。液相基因芯片除具有一般固相基因芯片的功能如核苷酸测序、单核苷酸多态性分析、基因作图等,还具有精确的同时定性、定量分析特征。液相蛋白芯片 :临床检测包括 :1 抗原抗体定量定性检测;2 细胞因子检测。测序技术第一代 -Sanger链终止法一代测序技术就是20 世纪 70 年代中期由Fre

20、d Sanger及其同事首先发明。其基本原理就是, 聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料就是均一的单链DNA分子。第一步就是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火, 然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂( 双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3OH基团 , 所以可被用作链终止试剂) 通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后,DNA 聚合酶用 dNTP延伸引物。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - -

21、- - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 5 页，共 7 页 - - - - - - - - - - PCR实验室 (相关资料 ) 延伸反应分四组进行, 每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核苷酸) 中的一种来进行终止, 再用PAGE 分析四组样品。从得到的PAGE 胶上可以读出我们需要的序列。第二代 -大规模平行测序大规模平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一, 还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术

22、有助于人们以更低廉的价格, 更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品, 例如美国Roche Applied Science公司的 454 基因组测序仪、美国Illumina公司与英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的 SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理就是边合成边测序。在Sanger 等测序方法的基础上 , 通过技术创新 , 用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当 DNA聚合酶合成互补链时

23、, 每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光, 根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。以 Illumina测序仪说明二代测序的一般流程,(1)文库制备 , 将 DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶与外切核酸酶把DNA片段切成平末端, 紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。(2) 簇的创建 , 将模板分子加入芯片用于产生克隆簇与测序循环。芯片有8 个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结

24、构 , 以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。(3)测序 , 分三步 :DNA聚合酶结合荧光可逆终止子, 荧光标记簇成像, 在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。(4) 数据分析。 - 第三代 -高通量、单分子测序被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪 ,PacificBioscience的 SMRT 技术与 Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。 不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序, 第三代分子测序 , 不需要进行PC

25、R扩增。（1）Helico BioScience 单分子测序技术。该测序就是基于边合成边测序的思想, 将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在 3 末端加上 poly(A),以及在 poly(A) 的末端进行荧光标记与阻断 , 把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置, 建立边合成边测序的位点加入聚合酶与被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA 合成 , 每次只加入一种脱氧核苷酸 , 然后将未参与合成的dNTP与 DNA聚合酶洗脱 , 直接对 Cy3成像 , 观测模板位点上就是否有荧光信号 , 然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放加入下一种脱氧核苷酸与聚合酶的混

26、合物, 进行下一轮反应。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 6 页，共 7 页 - - - - - - - - - - PCR实验室 (相关资料 ) (2)Pacific BioscienceSMRTT 技术。该测序也就是基于边合成边测序的原理, 这项技于使用了 Zero-ModeWaveguide(ZMW)( 零级波导 ) 。测序的过程 : 被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合( 每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记), 被激发出荧光 , 在荧光脉冲结束后,被标记的磷酸集团

27、被切割并释放, 聚合酶转移到下一个位置, 下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲, 进行下一个循环。(3)Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术。大多数纳米孔测序技术的基本原理就是当DNA分子或者它的组成碱基从一个孔洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxfordNanopore 测序技术就是以- 溶血素来构建生物纳米孔, 核酸外切酶依附在孔一侧的外表面,一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内,为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件, 脂双分子层两侧为不同的盐浓度在适合的电压下, 核酸

28、外切酶消化单链 DNA,单个碱基落入孔中, 并与孔内的环糊精短暂的相互作用,影响了流过纳米孔原本的电流, 腺嘌呤与胸腺嘧啶的电信号大小很相近, 但胸腺嘧啶在环糊精停留就是时间就是其她核苷酸的2-3 倍, 所以每个碱基都因其产生电流干扰振幅就是特有的而被区分开来。唐氏筛查唐氏综合症又叫做21三体综合征 , 先天愚型 , 就是说患者的第21对染色体比正常人多出一条( 正常人为一对 ), 就是最常见的染色体非整倍体疾病。唐筛检查 , 就是唐氏综合症产前筛选检查的简称。一种通过抽取孕妇血清, 检测母体血清中甲型胎儿蛋白 (AFP)、绒毛促性腺激素(HCG)、游离雌三醇(uE3) 与抑制素 A(Inhi

29、bin A)的浓度 , 并结合孕妇的预产期、 体重、年龄与采血时的孕周等, 计算生出先天缺陷胎儿的危险系数的检测方法。如果唐筛检查结果显示胎儿患有唐氏综合症的危险性比较高, 就应进一步进行确诊性的检查- 羊膜穿刺检查或绒毛检查。根据卫生部最新的产前筛查标准, 具有相应资质的检测单位根据开展的筛查方案, 在 5% 假阳性率前提下 ,孕中期二联 , 三联筛查与四联筛查, 对唐筛检出率分别应大于60%,70% 与 80% 。需要明确的就是 , 唐筛检查只能帮助判断胎儿患有唐氏症的机会有多大, 但不能明确胎儿就是否患上唐氏症。检查血清 AFP 、HCG 、uE3、Inhibin A还可筛查出神经管缺损(NTD)、18-三体综合征及13-三体综合征的高危孕妇。筛查时间 : 最佳时间就是在孕1520 周。 (16 18 周之间 ) 唐氏综合征还没有比较有效的治疗方法, 最好就是终止妊娠。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 7 页，共 7 页 - - - - - - - - - -